[发明专利]一种用于λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法

说明书

本发明公开了一种用于λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆检测的引物及检测方法。属于生物技术工程领域。本发明提供一种通用检测引物，其设计方法为在四环素tetRA基因中间约1/3处设计一对互补的引物，与原有的检测重组阳性的鉴定引物进行组合使用，分别用于检测以四环素基因tetRA为替换基因的λ‑Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的3’端序列和5’端序列。这样设计检测引物使检测重组阳性克隆有了3种选择，可以完全避免因为待敲除的序列与四环素tetRA基因相差较小而带来的难以判断阳性结果难题。而且用通用引物检测重组阳性克隆，可以更有效的证明四环素tetRA基因插入位置的正确性。

技术领域

本发明属于生物技术工程领域，具体涉及通过λ-Red重组系统对目标基因敲除后，对重组阳性克隆进行检测的引物及检测方法。

背景技术

基于λ噬菌体Red重组酶的同源重组系统目前广泛用于大肠杆菌基因工程研究。Red重组系统由三种蛋白组成：Exo蛋白是一种核酸外切酶,结合在双链DNA 的末端，从5'端向3'端降解DNA，产生3'突出端；Beta蛋白结合在单链DNA上，介导互补单链DNA退火；Gam蛋白可与RecBCD酶结合，抑制其降解外源DNA 的活性。Red同源重组技术具有同源序列短(40～60bp)、重组效率高的特点。这种技术可在DNA靶标分子的任意位点进行基因敲除、敲入、点突变等操作，无需使用限制性内切酶和连接酶。

四环素抗性基因tetRA作为遗传筛选标记容易检测，而且具有条件致死特性，因此常作为替换基因用于取代需要敲除的基因或插入序列。Red同源重组技术使难度较大的基因工程实验顺利进行，大大推动功能基因组研究的发展。四环素抗性tetRA基因作为敲除目的基因的替换基因，其大小为1911bp；同源重组序列通常为目标基因两侧同源臂序列，以长度为40bp为例；用于鉴定基因是否重组的鉴定引物选择位置通常为同源重组序列外侧同源臂，以长度为18bp为例；因此用于同源重组的片段大小为1911+40+40＝1991bp；重组阳性的PCR检测结果为1991+18+18＝2027bp，相应的阴性对照大小为：原基因大小 x+40+40+18+18＝x+116bp。由于待敲除基因大小不一，如果待敲除的序列与四环素抗性tetRA基因的片段大小相差较大，则阳性结果与阴性对照的片段相差较大容易识别；如果待敲除基因序列与四环素抗性tetRA基因片段大小相差较小，则由于琼脂糖凝胶电泳的分辨率问题，会导致很难识别阳性结果与阴性对照，进而无法准确判断结果。

发明内容

为克服现有检测方法的不足，本发明的目的是提供一种通用检测引物，其设计方法为在四环素tetRA基因中间约1/3处设计一对互补的引物，与原有的检测重组阳性的鉴定引物进行组合使用，分别用于检测以四环素基因tetRA为替换基因的λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的3’端序列和5’端序列。这样设计检测引物使检测重组阳性克隆有了3种选择，可以完全避免因为待敲除的序列与四环素tetRA基因相差较小而带来的难以判断阳性结果难题。而且用通用引物检测重组阳性克隆，可以更有效的证明四环素tetRA基因插入位置的正确性。

本发明另一目的，提供一种以四环素基因tetRA为替换基因的λ-Red重组系统基因敲除重组阳性的检测方法。

为了实现上述目的本发明采用如下技术方案：

第一方面，提供一种以四环素抗性基因tetRA为替换基因的λ-Red重组系统基因敲除重组阳性克隆的检测方法，包含如下步骤：

(1)设计引物：