[发明专利]一种高效获取小鼠肺脏全免疫细胞的方法

说明书

本发明涉及动物细胞提取方法，旨在提供一种高效获取小鼠肺脏全免疫细胞的方法。该方法包括：经心脏持续灌流、冲洗小鼠肺脏后，剪碎肺脏进行解离和消化；过滤后多次离心处理，对所得沉淀进行裂解以完全去除红细胞；终止裂红后再次离心处理；弃上清，得到纯净肺脏全免疫细胞。本发明能够在保证细胞纯度的基础上分离出高得率的小鼠肺脏全免疫细胞.与现有技术中研磨法分离的结果相比，本发明分离的小鼠肺脏全免疫细胞得率在大于5×10⁶/只，高于研磨法得率的1～2.5×10⁶/只，且细胞活率大于95％，大于传统研磨法细胞活率约85％。

发明领域

本发明涉及动物细胞提取方法，特别涉及一种高效获取小鼠肺脏全免疫细胞的方法。

背景技术

肺脏是气体交换，维持生命的重要器官，肺脏的免疫细胞可以感知外界环境带来的各种变化，以保证肺部免疫系统的稳定，肺部免疫细胞的失调，会导致多种肺部疾病的发生。肺脏内固有免疫细胞和反应性免疫细胞在肺脏中发挥着重要的免疫调节作用。因此高效分离得到肺脏全免疫细胞尤为必要。

传统的分离方法将肺脏组织研磨，根据细胞密度采用离心，这样分离得到的免疫细胞得率较低，而且只能分离特定密度的细胞亚群，不能有效分离肺脏内所有免疫细胞。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中不足，提供一种高效获取小鼠肺脏全免疫细胞的方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种高效获取小鼠肺脏全免疫细胞的方法，包括以下步骤：

(1)用75％酒精棉擦拭小鼠尸体，剪开胸部；

(2)以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)经心脏持续灌流、冲洗肺脏，清除内部血液使肺脏从血红色变为白色；

(3)分离出小鼠肺脏，置于含有磷酸盐缓冲液的培养皿内浸洗；

(4)将肺脏剪碎后置于含有2.4毫升改良杜氏伊格尔培养基(dulbecco’smodified eagle medium,DMEM)和0.3毫升酶混合液的解离管内；

(5)将解离管放入德国MACS公司GentleMACSTMDissociator解离机器中，以m_lung_01模式运行两次；

(6)取出解离管，置于37℃恒温、220转/分钟转速的摇床上消化30分钟；

(7)消化结束后，将解离管再次置于解离机器中，以m_lung_02模式运行一次；

(8)将解离管内混悬液以100微米滤器过滤到15毫升离心管内，用2.5毫升磷酸盐缓冲液重悬解离管内残留物后，再次将液体部分过滤至离心管内；

(9)在室温条件下，以相对离心力300g离心处理10分钟；

(10)弃掉上清液后，向沉淀内加3毫升36％的Percoll细胞分离液；在室温条件下，以相对离心力600g离心处理15分钟；

(11)弃掉包含肺细胞碎片的上清液，并向沉淀内加入3毫升红细胞裂解液(ACKlysis buffer)裂解3分钟以完全去除红细胞；然后加入5ml磷酸盐缓冲液终止裂红，在4℃条件下以相对离心力400g离心处理5分钟；弃上清，得到纯净的小鼠肺脏全免疫细胞。

本发明中，所述磷酸盐缓冲液中包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾，总浓度为0.01摩尔/升，酸碱度(pH值)7.4。

本发明中，所述酶混合液的配置方法为：向100毫升磷酸盐缓冲液里加入12毫克胶原酶Ⅳ、30毫克链酶蛋白酶和5毫克脱氧核糖核酸酶Ⅰ粉末，混匀。