[发明专利]一种急性肝衰竭小鼠肝脏全免疫细胞特征图谱的绘制方法

权利要求书

1.一种急性肝衰竭小鼠肝脏全免疫细胞特征图谱的绘制方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)小鼠肝脏全免疫细胞的提取

取因急性肝衰竭而自然死亡的新鲜小鼠尸体，摘取肝脏并灌流出其内部的血液；将肝脏剪碎后以酶混合液消化半个小时，再进行密度梯度离心和红细胞裂解，得到纯净的小鼠肝脏全免疫细胞；

(2)质谱流式抗体的标记

使用美国Fluidigm公司的MaxPAR X8抗体偶联试剂盒，以稳定的金属同位素与小鼠肝脏免疫细胞表面标志物抗体连接，得到标记抗体；

(3)免疫细胞抗体染色

将分离得到的小鼠肝脏全免疫细胞与标记抗体进行孵育，标记免疫细胞；

(4)质谱流式分析

将标记后的小鼠肝脏全免疫细胞在质谱流式上机分析，采用t-SNE和X-shift算法对所得数据进行分析；然后将不同的细胞亚群的多个检测抗体的表达分布在同一张热图上，并通过viSNE图表现不同标志物的表达以及不同细胞亚群的分布，以此表现小鼠肝脏全免疫细胞的分类图谱。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：

(1.1)用75％酒精棉擦拭小鼠尸体，剪开腹部分离出小鼠肝脏，保留胆囊和至少1厘米长度的主血管；

(1.2)以磷酸盐缓冲液经肝门静脉持续灌流、冲洗肝脏，清除内部血液使肝脏从血红色变为白色；

(1.3)剥离胆囊和主血管，将肝脏置于含有磷酸盐缓冲液的培养皿内浸洗；

(1.4)将肝脏剪碎后置于含有4.7毫升改良杜氏伊格尔培养基和0.3毫升酶混合液的解离管内；

(1.5)将解离管放入德国MACS公司GentleMACS^TMDissociator解离机器中，以m_liver_03模式运行两次；

(1.6)取出解离管，置于37℃恒温、220转/分钟转速的摇床上消化30分钟；

(1.7)消化结束后，将解离管再次置于解离机器中，以m_liver_04模式运行两次；

(1.8)将解离管内混悬液以100微米滤器过滤到50毫升离心管内，用5毫升磷酸盐缓冲液重悬解离管内残留物后，再次将液体部分过滤至离心管内；

(1.9)在室温条件下，以相对离心力300g离心处理10分钟；

(1.10)弃掉上清液后，向沉淀内加3毫升36％Percoll细胞分离液；在室温条件下，以相对离心力600g离心处理15分钟；

(1.11)弃掉包含肝细胞碎片的上清液，并向沉淀内加入2毫升红细胞裂解液裂解3分钟以完全去除红细胞；然后加入5ml磷酸盐缓冲液终止裂红，在4℃条件下以相对离心力400g离心处理5分钟；弃上清，得到纯净的小鼠肝脏全免疫细胞。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液中包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾，总浓度为0.01摩尔/升，酸碱度7.4。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述酶混合液的配置方法为：向100毫升磷酸盐缓冲液里加入12毫克胶原酶Ⅳ、30毫克链酶蛋白酶和5毫克脱氧核糖核酸酶Ⅰ粉末，混匀。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：在将剪碎后的肝脏置于解离管内之前，先将含改良杜氏伊格尔培养基和酶混合液的解离管置于37℃水浴中预热5分钟。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述Percoll细胞分离液的配置方法为：先将1毫升10倍磷酸盐缓冲液与9毫升percoll原溶液混合均匀，再加入15毫升1倍的磷酸盐缓冲液得到25毫升36％的Percoll分离液。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的10倍磷酸盐缓冲液中包括氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和氯化钾，总浓度为0.1摩尔/升，酸碱度7.4。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1.9)、(1.10)中启动离心机前，应先将离心机升速降速均调整到最低档。