[发明专利]一种血红蛋白偶联物的制备方法

权利要求书

1.一种血红蛋白偶联物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

分离红血球：将牛血在低温冷冻条件下进行离心，得到红血球；

溶血：在氮气保护、4～8℃条件下，往溶血罐内加入4～8倍红血球重量的、pH为7.4±0.1、渗透压130±10mOsm的低渗溶液，搅拌60～100min，得到溶血后溶液；

分离血红蛋白与细胞膜基质：将溶血后溶液进行切向流过滤，除红血球残骸；

层析纯化：超滤浓缩换阴离子层析液，当血红蛋白含量达到11～13g/dL时停止超滤，得到超滤后溶液；将超滤后溶液进行阴离子交换层析，去除磷脂、杂蛋白；

修饰反应：除病毒，超滤浓缩换修饰液至血红蛋白初始浓度为5.0±0.2g/dL，得到血红蛋白溶液；将血红蛋白溶液与单甲氧基聚乙二醇修饰液混合，在pH值pH8.6±0.1、温度4～10℃条件下进行修饰反应，修饰反应的时间为50～70min，终止反应，得到血红蛋白偶联物溶液；

灭活病毒：对血红蛋白偶联物溶液进行巴氏灭活；

超滤换液层析：将巴氏灭活后的血红蛋白偶联物溶液进行超滤浓缩换阳离子层析液；将超滤浓缩换液后的血红蛋白偶联物溶液进行阳离子交换层析、超滤浓缩换配方液、除菌过滤，得到血红蛋白偶联物；

在分离红血球步骤中，所述离心的温度为4～8℃，所述离心的转速为3500～4500r/min；

所述低渗溶液为磷酸盐溶液；

所述阴离子交换层析所用缓冲液的pH为7.4±0.1，渗透压为130±10mOsm，上样速度2.5L/min；

所述超滤浓缩换阴离子层析液为采用pH7.4±0.1磷酸盐缓冲溶液进行超滤换液；

所述超滤浓缩换修饰液为采用pH8.6±0.1磷酸盐缓冲溶液进行超滤换液；

所述超滤换阳离子层析液为采用pH6.2±0.1磷酸盐缓冲溶液进行超滤换液；

所述超滤浓缩换配方液为采用pH7.6±0.1磷酸盐缓冲溶液进行超滤换液。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在溶血步骤中，搅拌采用螺旋桨式搅拌器进行搅拌，所述螺旋桨式搅拌器与溶血罐的桨径比为0.4～0.6，搅拌转速为60～100转/分钟。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述切向流过滤的孔径为0.22μm，所述超滤的截留分子量为30KD。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述修饰反应中，血红蛋白与单甲氧基聚乙二醇的摩尔比为1：(8～18)。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述巴氏灭活的温度为60～61℃，时间为10～12小时。