[发明专利]一种抗BAP31单域抗体及其应用

说明书

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种抗BAP31单域抗体及其应用。单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，编码SEQ ID NO.8的核苷酸序列由3个框架区和3个抗原结合区组成。从人源噬菌体单域抗体库筛选获得能够与BAP31特定氨基酸序列(164‑206 aa)结合的单域抗体。本发明提供了编码该抗体的氨基酸和核苷酸序列，并包含该核苷酸序列的表达载体和宿主细胞。本发明的抗BAP31单域抗体VH‑F12可以与BAP31特定区域BAP31_{(164‑206 aa)}特异性结合，可用于BAP31的测定和治疗性抗体药物。

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域，具体涉及一种抗BAP31单域抗体及其应用。

背景技术

BAP31是位于内质网(Endoplasmic reticulum,ER)上的一个跨膜蛋白，最初把它作为B细胞受体相关蛋白(B cell receptor associated protein,BAP)，命名为BAP31。

BAPs家族的4个无糖基化修饰成员：BAP29、BAP31、BAP32和BAP37。虽然它们的序列不同，但是它们具有相似的结构特征：一个疏水性的N端和一个具有α-螺旋结构的C端。BAP31的编码基因位于Xq28，编码246个氨基酸，成熟的BAP31分子量为28kDa。BAP31由3个跨膜片段和一个13kDa胞质尾构成，其N端位于内质网腔中，C端位于胞浆中。

BAP31作为一种新的肿瘤相关抗原，近年来被发现在多种肿瘤组织中高表达，目前已有多篇文献报道BAP31高表达可以促进肿瘤的发生与转移。我们在前期研究中，以化学合成法合成BAP31C末端含有39个氨基酸(第207-246个氨基酸)的多肽。以此段多肽BAP31_(207-246aa)为抗原，从人源噬菌体单域抗体库中筛选到能与其特异性结合的单域抗体。我们发现抗体VH-D1可以特异性抑制BAP31与p27^kip的结合，抑制p27^kip蛋白酶体降解，使细胞内p27^kip蛋白水平增加。因为p27^kip是一种周期相关蛋白，p27^kip蛋白水平增加，促进了胃癌细胞周期阻滞，从而达到抑制胃癌细胞增殖的目的[1]。

本发明在此研究的基础上，选取新的BAP31活性区域作为抗原(BAP31第164-206个氨基酸)，对于此段多肽的功能研究国内外未见报道。利用化学合成法合成含有43个氨基酸的多肽片段BAP31_(164-206aa)，以此为抗原，从人源噬菌体单域抗体库筛选与其特异性结合的单域抗体，并评价抗体对胃癌细胞的杀伤作用。发现筛选所得的单域抗体VH-F12可以特异性抑制BAP31与EpCAM的结合，显著降低EpCAM的表达水平。对VH-F12的抗肿瘤活性进行体内、体外评价，发现该抗体可以显著促进胃癌细胞自噬性死亡，其对肿瘤细胞的杀伤作用对比前期文献发表的抗体VH-D1[1]有大幅度提升。另外，我们发现VH-F12可以显著抑制胃癌干样细胞的干性和自我更新能力。由于新的理论提出肿瘤干样细胞是肿瘤形成、复发、恶性转移和耐受放化疗的根源，因此抗肿瘤药物不仅应该对肿瘤细胞有抑制作用，还应该有效的杀伤肿瘤干样细胞。VH-F12对胃癌细胞和胃癌干样细胞都表现出显著的杀伤作用，为开发单抗类抗肿瘤药物提供新的探索方向，对提高肿瘤治疗疗效有重要意义。

单域抗体仅由重链可变区单域结构域组成，其分子量大小是完整抗体的1/12，最初单域抗体是从鲨鱼或羊驼体内发现的，现在可以由人源化的噬菌体单域抗体库筛选获得。单域抗体具有高亲和性和特异性等特点。人源的单域抗体还具有免疫原性低、溶解性和稳定性较好等特点，因此更适合于治疗应用。此外，单域抗体由于其分子量小，易于穿透实体瘤，可以结合到常规抗体不易结合的狭小裂隙中。使单域抗体在抗肿瘤治疗和新药研发方面具有巨大潜力。