[发明专利]一种检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的引物及方法

权利要求书

1.一种检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的引物，其特征在于，该引物包括与发生甲基化的模板匹配的甲基化上游引物MF和甲基化下游引物MR，与未发生甲基化的模板匹配的非甲基化上游引物UF和非甲基化下游引物UR，所述甲基化上游引物MF：

5′-TATTATTGGTTTTTGAAGGAAATCG-3′，甲基化下游引物

MR:5′-CTACGTTCCAAAAAATAAAAAAACG-3′；其中，下划线标注的是和发生了甲基化的DNA相匹配的位点。

2.根据权利要求1所述的一种检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的引物，其特征在于，所述非甲基化上游引物UF：

5′-TTATTATTGGTTTTTGAAGGAAATTG-3′，非甲基化下游引物UR：

5′-TACATTCCAAAAAATAAAAAAACAAA-3′；其中，下划线标注的是和未发生甲基化DNA相匹配的位点。

3.根据权利要求1所述的一种检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的引物，其特征在于，所述引物中甲基化上游引物和下游引物的浓度比为1：1。

4.根据权利要求1所述的一种检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的引物，其特征在于，所述引物中非甲基化上游引物和下游引物的浓度比为1：1。

5.根据权利要求1所述的一种检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的引物，其特征在于，所述引物中甲基化引物的PCR扩增产物长度为117bp。

6.根据权利要求1所述的一种检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的引物，其特征在于，所述引物中非甲基化引物的PCR扩增产物长度为116bp。

7.一种检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)提取基因组DNA样品；

2)基因组DNA的亚硫酸氢盐修饰：采用EZ DNA Methylation-Gold Kit对DNA进行亚硫酸氢盐修饰和纯化；

3)修饰后的基因组DNA甲基化特异性PCR：MSP反应体系25-50μL，含 HotStart Green Master Mix 12.5-25μL，EZ DNA Methylation-Gold Kit修饰后的基因组DNA模板1-2.5μL，5μmol/L上、下游引物各1-2.5μL，灭菌双蒸水补足体积至25-50μL；

4)凝胶分析：取5μL MSP反应产物，采用2.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果进行分析。

8.根据权利要求7所述的一种检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的方法，其特征在于，所述修饰后的基因组DNA甲基化特异性PCR的PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性45s，60℃退火35s，-0.5℃/循环，72℃延伸50s，10个循环；95℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸10min。

9.权利要求1-6任意一项所述的检测隐色素基因CRY1启动子甲基化的引物在急性髓系白血病预后评估的应用。