[发明专利]一种高效提取橄榄叶片核酸物质的方法

说明书

本发明公开了一种高效提取橄榄叶片中高质量核酸物质的方法，其操作步骤主要包括取样、研磨、裂解、除杂、沉淀、纯化和溶解等。本发明针对橄榄富含多酚、多糖、蛋白质等杂质的特点，其在传统CTAB法的基础上，针对橄榄叶片特征进行深度优化，对样品用量、试剂种类、试剂浓度、反应时间、反应体积、操作步骤等进行系统改良，开发适用于橄榄嫩叶、成熟叶或老叶核酸物质高效率和高质量提取的方法。本方法可根据实际需求，选择提取橄榄叶片基因组DNA或总RNA，适用性广，实用性强，具有很好的应用价值。

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体涉及一种高效提取橄榄叶片核酸物质的方法。

背景技术

橄榄是我国热带亚热带地区特色名贵果树，其果实是国家卫生部公布的药食同源原料。我国是橄榄原产地和遗传多样性分布中心，种质资源极为丰富。然而，由于产地之间没有统一的橄榄命名标准，加上种质资源交流频繁，同名异物和同物异名现象非常普遍，因此基于现代分子标记技术开展橄榄种质资源鉴定工作对橄榄种质资源挖掘和优新品种审认定具有重要意义。此外，由于橄榄属于小宗果树，基础研究和应用基础研究起步较晚，其农艺性状差异、品质性状形成、抗逆性特征、功效成分积累等方面的机理尚不明确，阻碍了橄榄种质资源的创新利用和目标性状定向育种进程，深入开展橄榄相关方面的分子机理研究也有助于产业进一步发展。

DNA和RNA是生物体中重要的遗传物质，如何获得高质量的基因组DNA和总RNA是开展上述一系列工作的关键。然而，橄榄中富含多糖、多酚、蛋白质以及次级代谢产物等，往往在其核酸物质的提取过程中产生强烈的干扰影响，难以高效获得高质量橄榄核酸物质。例如，橄榄中大量的多糖容易导致RNA降解从而破坏其完整性，同时多糖物质也会包裹DNA导致提取过程中无法重悬溶解；橄榄中丰富的多酚类物质容易加速组织样品氧化和褐变导致提取失败，同时多酚类物质容易结合蛋白质或核酸物质形成大分子或聚合物，影响提取效果和质量。此外，橄榄中的蛋白质和其他次级代谢产物往往难以去除，无法有效纯化，影响核酸提取产物纯度，干扰后续应用过程。通过我们大量研究也发现，传统未经改良的核酸物质提取方法在橄榄样品中无法正常使用。针对橄榄富含多糖、多酚、蛋白质和其他次级代谢产物的特性，以及橄榄组织结构特征，开发高效的核酸物质提取方法意义重大。

发明内容

本发明的目的在于提供一种适用于高效获得高质量的橄榄叶片核酸物质的方法。针对橄榄富含多酚、多糖、蛋白质和其他次级代谢产物等杂质的特点，在传统CTAB法的基础上通过优化改良，开发适用于橄榄嫩叶、成熟叶或老叶核酸物质高效率和高质量提取的方法，本方法可根据实际应用需求，选择提取橄榄叶片基因组DNA或总RNA，适用性广，实用性强，成本低廉，具有很好的应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

所述高效提取橄榄叶片核酸物质的方法针对橄榄叶片特征，在传统CTAB法上进行优化和改良，其主要操作过程与传统CTAB法具有一定的相似度，包括取样、研磨、裂解、除杂、沉淀、纯化和溶解等。但本发明通过对样品用量、试剂种类、试剂浓度、反应时间、反应体积、操作步骤等进行系统改良，开发了适用于橄榄叶片并可同时高效率高质量提取基因组DNA和总RNA的方法。

具体步骤如下：

（1）取样：采集橄榄叶片，洗净，吸干叶表水分，摊凉，并去除叶脉。

（2）研磨：称取样品0.5-0.6g，于研钵中加入10mgPVP，液氮下研磨成匀浆，转移至新离心管中。

（3）裂解：加入10mL 65℃预热的质量体积比为3%的CTAB裂解液，加入100μLβ-巯基乙醇，置于65℃中温浴30min，期间颠倒混匀3次。

（4）除杂：裂解结束后，冷却至室温，设置离心机转速12000rcf和温度4℃，离心2min。取上清液4mL，加入苯酚氯仿异戊醇混合液（体积比为25:24:1）4mL，轻轻混匀，静置1min，设置步骤（4）离心机参数离心10min。