[发明专利]一种酶法降解2;6-二羟基苯甲酸的方法

说明书

本发明公开了一种酶法降解2,6‑二羟基苯甲酸的方法，包括以下步骤：步骤一：Sdc蛋白表达：步骤二：Sdc的纯化：步骤三：Sdc浓度测定：步骤四：Sdc活力测定。本发明采用已成功构建的带有His标签的Sdc大肠杆菌表达菌株，采用此表达菌株，对Sdc进行诱导表达，收集菌体，经超声破碎、离心后，获得了突变酶的粗酶液，使用His‑TRap亲和层析柱对带有His6标签的Sdc进行纯化，使用纯化后的Sdc分别在不同的温度和pH条件下与2,6‑二羟基苯甲酸进行反应，采用HPLC检测对产物或反应物进行检测，计算相应酶活，确定反应的最适条件，为Sdc的开发利用提供一定的理论支持。

技术领域

本发明涉及一种方法，尤其涉及一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法。

背景技术

水杨酸及其衍生物在医药、化工等领域应用广泛，但由于其有毒且自然降解时间长，会影响自然生态平衡和人类健康，因此，研究其降解方法对于实现绿色生产具有重要意义和必要性。而且，水杨酸及其衍生物的脱羧产物—苯酚及其衍生物，也是重要的有机化工原料，在化学工业、医药工业有着广泛的应用，既可作为化学合成的中间体，也是重要的化学药品原料。利用芳香酸脱羧酶催化水杨酸衍生物的脱羧反应，具有反应条件温和、专一性高等酶反应的共同特性，可以大大降低反应的能垒，使反应更容易进行。水杨酸脱羧酶(Salicylic acid decarboxylase，Sdc)也是其中之一，该酶是2010年由Kirimura研究小组在丝孢酵母Trichosporon moniliiforme WU-0401中发现的一种可逆酶。

除了能够催化以苯酚为底物的Kolbe-Schmitt反应生成水杨酸及其逆反应以外，水杨酸脱羧酶还可以催化2,4-二羟基苯甲酸和γ-二羟基苯甲酸脱羧生成间苯二酚，催化2,3-二羟基苯甲酸脱羧生成1,2-二羟基苯酚，催化4-氨基水杨酸脱羧生成3-氨基苯酚等，并且可以催化它们的逆反应，能够以碳酸氢盐作为CO2源，催化富电子酚衍生物的羧化反应，反应可以选择性地在羟基邻位上加上羧基。通过Sdc降解白果中的有毒物质—银杏酸，结果表明，Sdc可以在比较温和的条件下对含不同取代基的银杏酸均具有脱羧能力，这对于含有多种不同取代基侧链的银杏酸降解非常适合。以上研究说明，Sdc可专一性地识别酚羟基的邻位上的羧基，能够以羟基和羧基两个基团相邻的羟基苯甲酸为脱羧底物，具有较为广泛的底物适应性。但作为一个对水杨酸及其多个衍生物均具有催化脱羧能力的酶，其催化脱羧的作用机制还需要进一步的研究，比如针对底物2,6-二羟基苯甲酸，水杨酸脱羧酶发挥催化作用的最适温度以及最适pH是多少，还需进一步研究确定。

发明内容

为了解决上述技术所存在的不足之处，本发明提供了一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法。

为了解决以上技术问题，本发明采用的技术方案是：一种酶法降解2,6-二羟基苯甲酸的方法，包括以下步骤：

步骤一：Sdc蛋白表达：将表达质粒转化到宿主菌中，构建突变Sdc基因表达菌株，将菌株接种于Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为一号种子液；将一号种子液按0.8～1.5％的比例接种于新的Amp浓度为90～110μg·mL-1的LB液体培养基中，摇床培养为二号种子液，并使其OD600到达0.4～0.8，然后加入IPTG使其成为最终浓度为0.08～0.2mM的培养液，培养液经诱导、离心后，收集菌体备用；

步骤二：Sdc的纯化：将步骤一中收集的菌体用超声破碎缓冲液重悬，在冰浴中进行超声破碎，将破碎后的细胞破碎液进行离心分离，上清液即为粗酶液；将粗酶液用10～14％的SDS-PAGE检测蛋白表达情况，采用His-Trap亲和层析柱对Sdc进行纯化；

步骤三：Sdc浓度测定：使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定纯化酶Sdc的浓度；