[发明专利]一种大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法

说明书

本发明提供一种大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法，所述方法利用高温灭菌的米粒接种腐霉菌，然后用培养好的接种体接种大豆种质资源种子，采用蛭石为基质在温室培养，对所述植株的病害进行调查、分级并计算鲜重比，通过对植株鲜重比（Ratio of weight）和病害指数（Disease Index）进行方差分析和进行聚类分析，筛选抗性和感性资源，鉴定出对腐霉菌根腐病具有抗/耐性的新种质。本发明确定了大豆资源腐霉菌根腐病抗性标准评价体系，优化了病菌培养基配方，创建了米粒接种体培养和接种方法，研发了病害指数计算方法，该方法简单、实用、高效，也适用于大豆其他卵菌病害抗性鉴定研究。

技术领域

本发明属于植物种质资源利用研究领域，具体涉及一种大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法。

背景技术

大豆根腐病(Soybean root rot)是国内外大豆种植区发生比较普遍、危害较重的一种世界性土传病害，在我国东北大豆产区和黄淮地区，危害最重。

我国大豆主产区黑龙江省近几年发病面积不断扩大，其中黑龙江东北部地区的病害较重，近年来随着大豆重迎茬面积的增加，根腐病危害亦日趋严重。多年研究表明，大豆根腐病原菌主要包括疫霉菌(Phytophthora spp.)、镰孢菌(Fusarium spp.)和腐霉菌(Pythium spp.)。腐霉菌是一种危害性极强的土传真菌病害，国际上已经证实有20多个菌种对大豆致病。但由于分离比例低和与其他菌种致病性状相似等原因，对大豆腐霉根腐病研究报道还很少。复合腐霉菌是引发大豆根腐病重要病原菌，全面准确评价腐霉菌病害抗性种质资源，是大豆病害防治和抗病育种的重要前提。(王克晶，李福山；我国野生大豆(G.soja)种质资源及其种质创新利用,中国农业科技导报,2000,6(2):69-72：田清震，盖钧镒；野生大豆种质资源的研究与利用，植物遗传资源科学，2000，4(1)：61-65)

美国成功将9个疫霉根腐病抗性基因应用于商业育种，显著提高了品种抗性，我国在抗病大豆新品种的培育上与国外差距很大，亟待有新突破。本发明利用米粒接种体接种鉴定大豆种质资源，建立精准高效大豆腐霉根腐病抗性技术体系，为培育高抗大豆新品种提供基因资源，对有效利用优异种质资源进行大豆抗性改良具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是利用米粒接种法精准鉴定大豆腐霉根腐病抗性资源，本发明提供了大豆腐霉接种体制备，抗/耐性资源鉴定、筛选的新种质方法。

本发明的技术方案：

大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法，所述大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法利用在培养基生长的菌体和灭菌的长粒大米制备腐霉根腐病接种体，然后利用米粒接种法温室接种培养筛选出对大豆腐霉根腐病具有抗/耐性的大豆种质资源，为选育大豆新品种提供具有抗/耐腐霉根腐病的新种质。

进一步地，所述大豆腐霉根腐病抗性资源精准鉴定方法包括如下步骤：

(1)腐霉菌的超长期保存(12-36个月)：将6粒大麻种子和1ml蒸馏水放入无菌瓶中灭菌，无菌环境下取2mm×2mm菌块，放入准备好的装有大麻种子和水无菌瓶中18-20℃长期保存；

(2)腐霉菌的长期保存(2-5个月)：将土豆、胡萝卜20g清洗、研磨，过滤后收集液体，加入烧杯，加水和琼脂糖20g，最后定容至1L，待加热待琼脂糖完全溶解后灭菌；将灭菌后的土豆、胡萝卜琼脂糖培养基导入小的灭菌瓶，灭菌瓶保持45度倾斜，冷却至室温。接种方法：将步骤(1)中储藏的菌块在无菌环境下小心放入无菌瓶中培养基的斜面，4℃保存；

(3)腐霉菌活化和培养：将玉米琼脂粉17g加入蒸馏水中，搅匀定容至1L，121℃灭菌25分钟，温度降至55℃后，加入1ml氨苄西林(250mg/ml)和1ml利福平(10mg/ml),然后分装到直径9cm的平板培养皿中室温冷却。接种方法：将步骤(2)储藏的菌块在无菌环境下小心切下1mm×1mm菌块，放入平板培养皿中培养4-7d；