[发明专利]乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法

说明书

本发明实施例提供的乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法，包括以下步骤：样品制备和对制备好的样品采用超高效液相色谱检测；其中：样品制备包括以下步骤：将乳样品用超纯水稀释、离心脱除乳脂肪和/或乳蛋白以获得游离低聚糖、对游离低聚糖进行荧光标记、上机检测前用超纯水将荧光标记低聚糖的浓度稀释至标准曲线范围之内。本发明的样品制备方法，对样本的需求量少(最低至10μL)，将先前报道的液相色谱‑荧光检测法的繁琐的样品制备方法简化，整个制备过程没有复杂的操作，仅需稀释和固定的离心操作，低聚糖衍生后不经过净化处理，减少了低聚糖的损失，大幅减少了人为随机误差的产生，提高了方法的易操作性、可靠性，提高了样品制备的通量。

技术领域

本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法。

背景技术

母乳中存在丰富的结构复杂的游离低聚糖(母乳低聚糖)，这些低聚糖在婴儿肠道中是浓度最高的碳水化合物。这类低聚糖不能被人体直接消化利用，其最重要的一个生物功能是促进婴儿肠道双歧杆菌的定植与维持双歧杆菌菌群优势。母乳与婴幼儿配方乳粉的一个最大差异是母乳中存在结构复杂和高浓度的游离低聚糖。而婴幼儿配方乳粉作为母乳喂养不足婴儿的重要营养来源，其主要成分是牛乳，虽然含有的主要低聚糖中有多种与母乳低聚糖相同结构的游离低聚糖，但含量极低。因此，准确的定量检测母乳中的主要游离低聚糖含量，对于获得代表性人群母乳中主要低聚糖的统计数据、开发低聚糖母乳化的婴幼儿配方乳粉、以及产品开发和监管具有重要意义。

超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)借助于HPLC(高效液相色谱)的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。作为世界第一个商品化UPLC产品的Waters ACQUITY UPLCTM超高效液相色谱系统在1996年问世，之后像安捷伦、岛津等公司也陆续开始生产超高效液相色谱仪。

现有使用超高效液相色谱-串联质谱法测定母乳中的12种母乳低聚糖的方法，主要步骤包括：超纯水稀释2倍——离心脱脂——乙腈沉淀蛋白——离心脱除蛋白——二次离心脱除蛋白——超纯水稀释——上机检测。在该方法中，存在以下不足：首先，利用质谱检测母乳低聚糖时，酸性低聚糖与中性低聚糖在离子化时相互抑制，如果使用正离子模式则中性低聚糖抑制酸性低聚糖的离子化，如果使用负离子模式则酸性低聚糖抑制中性低聚糖的离子化，从而影响检测灵敏度。第二，现有技术中采用超高效液相色谱-串联质谱法的方法，原因之一是在目前的条件下仅仅依靠超高效液相色谱对母乳低聚糖的分离效果满足不了分析要求，只能利用质谱的高选择性弥补这一不足。第三，母乳中一般含有3～4.6％的脂肪，虽然上述方法先用超纯水将母乳稀释2倍再离心脱除乳脂肪，但乳脂肪的体积含量仍较高，会对最终的低聚糖定量结果产生直接影响。第四，乙腈沉淀乳蛋白的效果虽然较好，但乙腈会降低母乳低聚糖的回收率。第五，液质联用设备是较为昂贵的精密仪器，而母乳中乳糖含量非常高(60～70mg/mL)，容易污染质谱的离子源、质量分析器，维护和保养费用较高，对检验员的技术要求比对液相色谱的操作要求高的多，使得整体检测成本较高。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

发明目的

本发明实施例的目的在于提供一种乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法。

解决方案

为实现本发明目的，本发明实施例提供了以下技术方案：

乳中游离低聚糖的高通量定量测定方法，包括以下步骤：样品制备和对制备好的样品采用超高效液相色谱法、而非采用液质联用法进行定量分析；