[发明专利]一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺

说明书

本发明公开了一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺，涉及微波预处理；超声波辅助酶解；超滤处理；CaCl₂螯合；以及凝胶柱处理；本发明通过Ca²⁺与抗氧化肽相结合，提高了抗氧化肽的结构稳定性，形成抗氧化钙离子螯合肽，具有较强的抗氧化活性以及在加工和贮藏过程中的抗氧化稳定性，并以金线鱼内脏为原料，来源广，成本低，解决了鱼糜加工过程中产生副产物的问题，对进一步提高金线鱼的经济价值值具有的理论意义；此外，本发明通过微波处理金线鱼内脏蛋白，降低蛋白中的有序结构并提高其的溶解性，在此基础上，将超声波处理和蛋白酶酶解结合，提高水解度和得率；同时通过多次分离纯化、获得可靠的金线鱼内脏抗氧化钙离子螯合肽。

技术领域

本发明属于水产加工技术领域，具体涉及一种低值鱼内脏蛋白源抗氧化钙离子螯合肽的高效制备工艺。

背景技术

金线鱼(Nemipterus virgatus)属鲈形目、金线鱼科、金线鱼属，广泛分布于、菲律宾、印尼、越南、泰国、澳洲等海域，其中我国以东海南部和北部湾海区产量最高，已成为当地乃至我国重要的海洋经济鱼类之一。由于金线鱼鱼肉具有肉厚刺少，肉质细腻的特点，常做为鱼糜加工过程中的主要原料。然而，金线鱼下脚料如鱼头、鱼鳞、鱼皮和内脏等被认为是渔业工程的副产物，而被大量丢弃，不仅造成了极大的浪费，也对环境产生很大的负担。研究表明，渔副产物约占鱼干重的35％左右，且含有大量优质蛋白源，是制备生物活性肽的良好原料。通过外源性蛋白酶酶解金线鱼下脚料，释放出具有潜在生物活性的肽段，可为金线鱼相关产业的深加工提供一定的理论基础。

抗氧化肽通常是由2-20个氨基酸组成的寡肽，具有清除自由基、螯合活泼金属离子和以及修复体内受损大分子的功效，并且可作为一种食品添加剂应用在食品工业中，具有抑制贮藏过程中食品脂质劣变、蛋白质氧化以及非酶促褐变等不利化学反应，从而提高食品的货架期。与商业抗氧化剂，如BHA、BHT和没食子酸丙酯等相比，抗氧化肽不仅具有较高的清除自由基活性，并且无副作用，可防止由传统抗氧化剂引发的肝功能损伤。此外，抗氧化肽还具有和制备成本低等特点，有利于工业化生产。现已从大豆、鹰嘴豆、小麦、大黄鱼等动植物蛋白中制备出高活性的抗氧化肽。然而，通过酶解法制备生物活性肽存在着效率低、酶解产物不稳定等缺点，由于外源性蛋白酶活性位点主要位于蛋白质的疏水中心，因此，在天然状态下，酶不易与活性位点相互作用，尤其是动植物边脚料中大量杂蛋白通过疏水作用聚合形成多聚体，导致酶解效率低下。目前国内外普遍采用超声波、酸解等物理或化学方法对原蛋白进行预处理，促进蛋白有序结构的展开，使蛋白多聚体解离为离散状的蛋白单体，从而提高溶液中酶与活性位点的接触率。例如。专利201010188418.1公开了一种制备燕麦降血压肽的超声辅助酶解方法，通过250-1250W/100mL的超声场对燕麦蛋白预处理，5-10min后关闭超声并转入碱性蛋白酶酶解，以提高降血压肽的得率和活性。然而，超声过后蛋白易迅速复性，重新形成球状蛋白结构。另外，超声作用可一定程度上促进蛋白凝胶化，不利于后续酶解步骤。微波的离子化效应可诱导蛋白质迅速解折叠，使α-螺旋与β-折叠转变为β-转角与无规则结构，蛋白质三级结构充分展开，有利于蛋白酶的酶解，但是有关利用微波场预处理原蛋白制备抗氧化肽还未见相关报道。

酶解法是制备生物活性肽的常用技术。然而，在酶解过程中常常存在底物抑制现象，导致酶活性随着酶解过程的深入而迅速下降，从而影响活性肽段的进一步释放。并且由于酶-肽复合物的形成，酶三维结构发生改变，使催化特异性发生改变，令催化产物发生变化。因此，通过超声波技术使酶-肽复合物迅速解离，降低由底物引起的非限制性抑制作用，因此，蛋白酶再酶解过程中能保持相对较高的活性。例如。专利201710412246.3公开了一种竹节虾抗氧化肽及其制备方法，通过通过超声波辅助酶解可大幅提高抗氧化肽的得率和清除自由基活性。然而，碱性蛋白酶结构域敏感度较高，外加超声场容易诱导蛋白酶变性。因此需要对超声场的强度、作用时间等条件进行严格控制。