[发明专利]具有简单糖型的重组蛋白的产生

说明书

本发明提供缺乏甘露糖基(α‑1,3‑)‑糖蛋白β‑1,2‑N‑乙酰氨基葡萄糖转移酶I(Mgat1)的细胞系。本发明还提供用于产生所述Mga1缺乏的细胞系的方法以及用于使用所述Mgat1缺乏的细胞系来产生具有简单糖型的重组蛋白的方法。

本申请是申请日为2013年1月10日，中国国家申请号为201380005345.X，发明名称为“具有简单糖型的重组蛋白的产生”的发明申请的分案申请。

发明领域

本发明涉及具有简单糖型的重组蛋白。具体来说，本发明涉及用于产生具有一个或多个末端甘露糖残基的重组糖蛋白的组合物和方法。

发明背景

N-连接的糖基化是见于许多分泌以及膜结合糖蛋白上的一种常见蛋白质修饰。合成复杂糖型需要一系列以逐步方式在真核细胞的内质网和高尔基体中进行的酶促反应。尽管大多数重组治疗性蛋白质需要存在复杂聚糖以避免免疫原性以及改进蛋白质半衰期，但也存在应用具有简单N-聚糖结构的糖蛋白。举例来说，具有简单糖型的重组蛋白有利于X射线结晶学研究。另外，仅具有末端甘露糖残基的简单糖型可通过促进甘露糖受体介导的对这些蛋白质的摄取而导致一些治疗剂的功效增加。

然而，用于产生治疗性糖蛋白的大多数细胞系产生具有异质或复杂N-连接的糖型的蛋白质。因此，对被工程改造来产生具有简单糖型的重组糖蛋白的细胞系存在需要。此外，合乎需要的是这些工程改造细胞系稳定产生具有末端甘露糖残基的蛋白质，同时保留在化学成分确定的培养基中的高蛋白质产率和强健生长。

概述

在本公开的各个方面之中，提供一种缺乏甘露糖基(α-1,3-)-糖蛋白β-1,2-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I(Mgat1)的细胞系。在一个实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系不产生Mgat1蛋白。在另一实施方案中，相对于不缺乏Mgat1的亲本细胞系，缺乏Mgat1的细胞系产生的Mgat1蛋白的量降低。在一个实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系包含编码Mgat1的失活染色体序列。可用靶向性核酸内切酶使编码Mgat1的染色体序列失活。在某些实施方案中，靶向性核酸内切酶选自锌指核酸酶、转录活化子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶(meganuclease)和位点特异性核酸内切酶。在一个实施方案中，靶向性核酸内切酶是锌指核酸酶。在一些实施方案中，编码Mgat1的染色体序列是由于缺失至少一个碱基对、插入至少一个碱基对、取代至少一个碱基对或其组合而失活。在某些实施方案中，编码Mgat1的染色体序列是由于缺失2-55个碱基对而失活。在一个实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系也缺乏谷氨酰胺合成酶(GS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)或其组合。在另一实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系是CHO细胞系。在一个实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系是通过缺失使编码Mgat1的染色体序列的单拷贝失活的CHO细胞系且所述细胞系不产生Mgat1。在另一实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系是通过缺失使编码Mgat1的染色体序列的单拷贝失活的CHO GS-/-细胞系且所述细胞系不产生Mgat1。在一个实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系表达至少一种具有简单糖型的糖蛋白，其中所述简单糖型包含一个或多个末端甘露糖残基。在一个实施方案中，Mgat1缺乏的细胞系与不缺乏Mgat1的细胞系具有类似生长速率。在一个实施方案中，缺乏Mgat1的细胞系与不缺乏Mgat1的细胞系产生类似蛋白质水平。