[发明专利]一种检测人MTHFR和MTRR基因突变的引物、探针及其试剂盒

说明书

本发明公开了一种检测人MTHFR和MTRR基因突变的引物、探针及其试剂盒，属于基因检测技术领域。本发明提供了检测人MTHFR C677T和A1298C基因突变与MTRR A66G基因突变的引物和探针SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:9；通过非对称PCR扩增和TaqMan探针熔解曲线分析技术检测人MTHFR C677T和A1298C基因突变与MTRR A66G基因突变，用于判断个体的叶酸利用能力，检测结果结合其他临床检测结果和临床症状可辅助诊断临床个体化叶酸增补。

技术领域

本发明属于基因检测技术领域，特别涉及一种检测人MTHFR和MTRR基因突变的引物、探针及其试剂盒。

背景技术

叶酸又叫维生素B9，是一种水溶性维生素，由蝶啶、对氨基苯甲酸和L-谷氨酸组成。叶酸是人体内重要的甲基供体，参与DNA合成、复制与修复和基因组与蛋白质的甲基化调控。体内叶酸缺乏与神经管闭合缺陷等新生儿出生缺陷疾病关系密切，同时也会增加心血管疾病、神经变性疾病、糖尿病、肾脏疾病、骨质疏松等多种疾病的患病风险。体内叶酸缺乏是环境与基因相互影响结果。人体不能合成叶酸，外源摄取是人体获取叶酸的唯一途径，因此膳食中也叶酸缺乏是导致体内叶酸缺乏的一个原因。另一方面，叶酸一碳代谢通路上关键酶基因突变导致对膳食所摄取叶酸利用能力低下。另外，现在已有显示过量增补叶酸可能会促进癌症发展。因此需要对个体的叶酸利用能力进行个体化评估以满足个体叶酸摄取的合理水平，避免叶酸缺乏或者长期增补过量。

5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(5,10-Methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR)是叶酸一碳代谢途径的关键酶，催化生成人体内最重要的间接甲基供体5-甲基四氢叶酸。已发现MTHFR存在30多种基因突变，其中对酶活性影响最大且最常见的是C677T(rs1801133)和A1298C(rs1801131)。前者发生于MTHFR预测的催化结构域，对酶活性影响大，研究显示最大可使酶活降低约70％；后者发生于MTHFR预测的调节结构域，对酶活性影响相对较小，其主要与前者且协同作用。

甲硫氨酸合成酶还原酶((Methionine syntesis reductas，MTRR/MSR)可以在NADPH存在条件下催化S-腺苷甲硫氨酸及钴胺素(II)使之重新形成甲钴胺素(III)，使甲硫氨酸合成酶(Methionine synthase，MTR/MS)催化的在5-甲基四氢叶酸—钴胺素—甲硫氨酸的一碳代谢循环可以正常进行。MTRR A66G(rs1801394)是MTRR基因上最常见的突变，引起MTRR基因编码的蛋白质第22个氨基酸由异亮氨酸变为甲硫氨酸，影响MTRR的酶活从而影响5-甲基四氢叶酸—钴胺素—甲硫氨酸的一碳代谢循环，特别是与MTHFR C677T突变协同作用时。

现有的针对人MTHFR和MTRR基因突变检测试剂盒基本采用基于TaqMan水解探针的荧光PCR方法，虽然相较于PCR-RELF、直接测序等方法具有具有检测快速、操作简便和不易交叉污染的优点，但受限于荧光PCR仪检测通道，仅能检测单一位点突变(MTHFR C677T)，不能全面覆盖相关基因突变位点，无法全面综合评估个体叶酸利用能力。另外，由于是单个碱基的差异，故无论采用常规PCR或者ARMS PCR均易出现非特异扩增曲线(存在非特异Ct)，因此对于检测结果经常采用二次计算结果(△Ct)并且需要限制加入的PCR模板浓度，额外增加检测操作和结果判读工作量。综上所述，目前急需建立一种仅需单一PCR反应管且完全区分仅有单个碱基差异的突变型与野生型同时覆盖MTHFR C677T(rs1801133)、A1298C(rs1801131)和MTRR A66G(rs1801394)三种基因突变的检测方法。

发明内容

为克服上述现有技术中存在的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测人MTHFR和MTRR基因突变的引物、探针。上述引物、探针为基于改善非对称PCR扩增和TaqMan探针熔解曲线分析检测人MTHFR和MTRR基因突变的引物和探针。