[发明专利]甘酪二肽条件培养基在间充质干细胞冻存和制备商品化冻存保护剂方面的应用

说明书

本发明公开了甘酪二肽条件培养基在间充质干细胞冻存和制备商品化冻存保护剂方面的应用。本发明研究发现甘酪二肽可以保证在不明显影响人羊水间充质干细胞表型、增殖活力和多向分化能力的前提下提高人羊水间充质干细胞的冻存复苏率，甘酪二肽以及含有甘酪二肽的条件培养基可以用于制备人羊水间充质干细胞的冻存保护剂。

技术领域

本发明属于干细胞领域，涉及干细胞冻存，具体涉及甘酪二肽条件培养基在间充质干细胞冻存和制备商品化冻存保护剂方面的应用。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潜能，是细胞治疗及基因治疗的理想种子细胞。已有研究显示：骨髓和脐血中均可以培养出MSCs，但骨髓源性MSCs存在病毒污染的可能和随着年龄增长细胞数量和扩增、分化能力出现明显下降趋势的缺点，而脐血MSCs培养存在收益率低，不稳定等缺点，应用都受到一定的限制。最近研究显示羊水是MSCs新的来源，相对骨髓和脐血而言，具有来源广阔、取材无创等优势。对羊水间充质干细胞(Amniotic fluid-derivedmesenchymal stem cells，AF-MSCs)的分离培养、冻存复苏、生物学特性的研究也逐渐增多。

冯建勋等研究了超低温冻存对人羊水间充质干细胞生物学特性的影响，通过羊膜腔穿刺取得人孕16～23周羊水，分离培养出人AF-MSC，将第4代人AF-MSC经短期超低温冻存、复苏后，通过细胞活性率测定、形态学比较、细胞增殖功能测定、细胞周期分析及细胞表面抗原检测，观察超低温冻存对人AF-MSC生物学特性的影响，结果第4代人AF-MSC冻存、复苏前后的两组细胞无论在细胞活性率、细胞形态、细胞增殖能力、细胞周期、细胞表面抗原的表达等方面均无显著性差异，证明短期的超低温冻存对人AF-MSC的生物活性无明显影响(超低温冻存对人羊水间充质干细胞生物学特性的影响，中国现代医学杂志，2010)。冯建勋等采用的冻存方法为：取约90％融合的生长旺盛的第4代AF-MSC，消化离心，去除上清，加入含50％α-MEM、40％胎牛血清及10％DMSO的冻存保护液，制成细胞悬液，以10⁶/mL的密度，总体积为1mL，装入2mL的冻存管中，将冻存管先置于4℃冰箱1h，然后转移至-80℃低温冰箱中过夜，最后投入液氮罐内(-196℃)长期冻存。遗憾的是，该文献并没有公开-196℃冻存时间，导致其参考价值大打折扣。

王一茹等对人羊水来源间充质干细胞冻存后的生物学特征进行了研究，其采用的冻存方案为：采用不同比例的DMEM培养基、胎牛血清和DMSO，梯度降温至-80℃过夜，次日投入液氮冻存12周，且最优条件下细胞存活率仅为82％～83％(人羊水来源间充质干细胞冻存后生物学特征研究，中国修复重建外科杂志，2012)。

结合文献报道和实践，如何提高人羊水来源间充质干细胞的冻存效果，采用何种组成的冻存培养基，采用何种冻存方案，冻存时间如何选择都面临很多技术难题需要克服。目前，为了提高人羊水来源间充质干细胞的冻存复苏率，基本都会使用到液氮超低温冻存，但是，液氮超低温冻存的冻存、复苏过程步骤较多，复苏过程的温度骤变对细胞的损伤也不容忽视。一个月左右的短期冻存采用零下八十度更为实际，但是需要保证足够的冻存复苏率。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供甘酪二肽条件培养基在人羊水间充质干细胞冻存和制备商品化冻存保护剂方面的应用，以保证在不明显降低人羊水间充质干细胞增殖活力和多向分化能力的前提下提高人羊水间充质干细胞的冻存复苏率。

本发明目的通过以下方案实现：

甘酪二肽条件培养基在人羊水间充质干细胞冻存方面的应用。。

进一步地，所述甘酪二肽条件培养基为含有甘酪二肽的低糖DMEM培养基。

更进一步地，甘酪二肽浓度为100nM。

进一步地，用于在不明显影响人羊水间充质干细胞表型、增殖活力和多向分化能力的前提下提高人羊水间充质干细胞的冻存复苏率。