[发明专利]同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒

权利要求书

1.同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述人冠状病毒具体为MERS-CoV/HCoV-NL63/HCoV-OC43/HCoV-HKUI；所述检测试剂盒具体包括：特异性引物对和探针四组，阳性质控品和阴性质控品；

所述每组异性引物对和探针均包括一对特异性引物对和一条探针序列；所述阳性质控品具体为一条人工合成的靶序列，阳性质控品靶序列具体如SEQ ID No.13；阴性质控品为去离子水或无菌水；

针对人冠状病毒MERS-CoV，特异性引物对包括引物1和引物2，引物1的序列如SEQ IDNo.1，引物2的序列如SEQ ID No.2；探针1序列如SEQ ID No.3；

针对人冠状病毒HCoV-NL63，特异性引物对包括引物3和引物4，引物3的序列如SEQ IDNo.4，引物4的序列如SEQ ID No.5；探针2序列如SEQ ID No.6；

针对人冠状病毒HCoV-OC43，特异性引物对包括引物5和引物6，引物5的序列如SEQ IDNo.7，引物6的序列如SEQ ID No.8；探针3序列如SEQ ID No.9；

针对人冠状病毒HCoV-HKUI，特异性引物对包括引物7和引物8，引物7的序列如SEQ IDNo.10，引物8的序列如SEQ ID No.11；探针4序列如SEQ ID No.12；

采用不同的荧光色对探针1序列、探针2序列、探针3序列、探针4序列四条探针序列进行荧光标记，对所述探针序列的5’端进行标记的荧光基团具体为FAM、VIC、ROX和Cy5，对3’端进行标记的淬灭基团为MGB；

所述阳性质控品序列中包含了一段覆盖MERS-CoV特异性引物、探针的102bp的目的片段，覆盖HCoV-NL63特异性引物、探针的109bp的目的片段，覆盖HCoV-OC43特异性引物、探针的122bp的目的片段，覆盖HCoV-HKU1引物、探针的143bp的目的片段。

2.如权利要求1所述同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒，其特征是：所述阳性质控品序列由人工合成后直接用作阳性质控品，或人工合成后构建到质粒载体上，通过摇菌提取克隆质粒作为阳性质控品。

3.权利要求1或2所述四重荧光定量检测试剂盒的应用，其特征是：将其应用于同时对MERS-CoV、HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-HKUI四种人冠状病毒进行非诊断目的的检测。

4.一种采用权利要求1或2所述的同时检测四种人冠状病毒的四重荧光定量检测试剂盒进行非诊断目的检测的方法，其特征是，步骤如下：

（1）样本核酸的提取：取待检测样品，对其进行核酸提取，得到样本核酸；

（2）qRT-PCR检测：采用MERS-CoV/HCoV-NL63/HCoV-OC43/HCoV-HKUI特异性引物和探针序列、2Х 反应液、DNA聚合酶和RT逆转录酶及步骤1提取的样本核酸配置反应体系；取阳性质控品和阴性质控品分别配置与样本核酸一致的反应体系；对上述三个反应体系进行qRT-PCR检测；

（3）分析判断：通过步骤（2）阴性质控品所得荧光信号最高点调整阈值，控制阳性质控品在四个检测通道均有S型扩增曲线；随后将样本核酸所得扩增曲线与阳性质控品进行对照，判读结果。

5.如权利要求4所述采用四重荧光定量检测试剂盒进行非诊断目的检测的方法，其特征是步骤（2）所述qRT-PCR扩增程序如下：42℃反应10 min；95℃反应5min；随后进行循环反应40次，循环程序为：94℃反应10~30s，58~60℃反应30~60s，收集荧光。

6.如权利要求4所述采用四重荧光定量检测试剂盒进行非诊断目的检测的方法，其特征是步骤（3）分析判断过程具体如下：

a、调整阈值：阈值设定原则为以刚好超过阴性质控品的荧光信号最高点为阈值线，或根据仪器噪音情况进行调整；

b、质量控制：阴性质控品无扩增曲线，且阳性质控品在FAM、VIC、ROX和Cy5四个检测通道均有S型扩增曲线，实验成立；否则实验结果无效；

c、结果判定：

c1、若检测样品有S型扩增且Ct或Cq值≤38，根据检测目标所对应的荧光通道进行判读；

c2、若有S型扩增，且38Ct或Cq值40，判定为不确定样品，需重新提取核酸后进行检测；

c3、若复检样品与c2的结果一致，则可判定样品为弱阳性；

c4、若无明显S型扩增曲线，但报告有Ct或Cq值，为非特异性扩增，判定为阴性。