[发明专利]一种神经元冻存液的制备方法

说明书

本发明公开了一种神经元冻存液的制备方法，包括以下步骤：取样、消化、制备细胞悬液、冻存以及复苏步骤；所用的神经元冻存液以及培养基中均不含有谷氨酰胺。上述神经元冻存液的制备方法中，将原代神经元与本发明的冻存液混合后冻存，能够降低神经元冻存损伤，复苏后神经元活率高，活性强。进一步地，本发明的取样分离神经组织的方法快捷方便，避免神经元损伤和细胞污染，提高取样效率并且有利于后续消化处理。

技术领域

本发明属于组织细胞培养技术领域，具体涉及一种神经元冻存液的制备方法。

背景技术

在围绕神经系统的研究中，神经元的原代分离培养是非常重要的体外研究，用于研究神经细胞的各种生理功能，由于神经组织获得的局限性，关于神经元原代分离主要是在啮齿类哺乳动物上进行。例如，常用于神经元原代分离的啮齿类动物有胎鼠、新生鼠。然而由于神经元细胞缺乏增殖能力，一次原代分离后，在体外不适宜长期存活、生长、分化，不利于研究的顺利进行；此外，对于原代神经元来说，其对外界环境尤为敏感，不良刺激后极易死亡，所以神经组织的原代细胞体外实验中，一般都是现用现分离新鲜组织培养，这就导致了在研究原代神经元时，由于研究目标取材的限制，例如胎鼠、新生鼠获取的不易、周期较长，综合导致研究周期成本的增高。

细胞冷冻技术作为一种保存细胞的有效方法在生物学领域已深入广泛的应用。研究人员经常需要冷冻细胞并保存，以供后续实验或临床使用。传统的低温冷冻保存技术是将二甲亚砜和血清中加入细胞混悬液后放入冻存管中，于-80℃冰箱慢慢冷冻后，将冻存管置于液氮中保存，使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，需要时快速解冻。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。除此之外，还可以利用细胞冻存的形式来购买、寄增、交换和运输某些细胞。细胞冻存时加入保护剂终浓度5％-15％的甘油或二甲基亚砜(DMSO)，可使溶液冰点降低，在缓慢冻结条件下，细胞内水分透出，减少了冰晶形成，从而避免细胞损伤。采用慢冻快融的方法能较好地保证细胞存活。

若采用冻存技术冻存原代神经元，不仅可解决分离成本，也可最大化地使用样本材料。然而现有的利用二甲亚砜、血清混合液作为冻存液冻存原代神经元时，往往对神经元造成冻存损伤，导致神经元复苏后无法继续正常存活。低温冻存对细胞产生的损伤主要有以下几个方面：细胞流动性减小，细胞膜讲话导致细胞的进一步损伤，抑制了Na⁺/K⁺ATP酶，引起细胞膨胀；导致细胞坏死凋亡；产生氧自由基。如何减轻原代神经元的低温冻存的损伤，提高复苏后神经元的存活率以及活性是本领域亟待解决的问题。

发明内容

本发明针对传统的冻存方法无法避免神经元冻存复苏活率低、活性差的问题，提供一种神经元冻存液的制备方法。

本发明提供的一种神经元冻存液的制备方法，包括以下步骤：

取样：取离体哺乳动物的神经组织，剪碎后置于第一离心管中以800～1200rpm离心4～6min，去除离心上清液；

消化：向所述第一离心管中加胰酶，将所述第一离心管中的沉淀细胞吹开，抽出沉淀细胞置于消化培养皿中，向所述消化培养皿中追加胰酶，将所述消化培养皿放置于37℃培养箱中8～12min后，向所述消化培养皿中加入种植培养基终止消化；

制备细胞悬液：将所述消化培养皿中的混合物经细胞筛过滤后，加入第二离心管中，以800～1200rpm离心4～6min，离心后去除上清液，制得原代神经元；

冻存：将所述原代神经元与冻存液混合后制得冻存细胞液，将所述冻存细胞液置于冻存管中，于-20℃冰箱内冷冻1.0～2.0h后于-80℃冰箱内冷冻；

复苏：将所述冻存管快速置于37℃水浴中速溶，将融解后的所述冻存细胞液以800～1200rpm离心4～6min，离心后去除上清液，制得冻存后神经元，将所述冻存后神经元转入种植培养基或复苏培养基培养；