[发明专利]粗品肝素钠制备肝素钠和硫酸乙酰肝素钠的方法

说明书

本申请公开了一种粗品肝素钠制备肝素钠和硫酸乙酰肝素钠的方法，步骤包括：一、粗品肝素钠酶解：二、树脂吸附：三、树脂清洗：四、硫酸乙酰肝素钠的收集；五、肝素钠的收集。本发明申请的优点在于：一、分离过程中均采用物理分离的方法，这样不会破坏肝素和硫酸乙酰肝素的化学结构，从而有效提高产品活性，肝素钠的绵羊血浆活性可以达到130U/mg以上。二、本方法得到的肝素/硫酸乙酰肝素只需经过氧化脱色和乙醇分级沉淀，即可得到原料药级的肝素与硫酸乙酰肝素。三、工艺路线简单，工艺设备要求低，工艺简单，效率、收率、纯度高，有机溶剂的用量小，工艺放大容易，所需设备简单，处理量大，适合用于工业化生产。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及从粗品肝素钠中分离肝素钠和硫酸乙酰肝素钠的方法。

背景技术

肝素(Heparin，HP)是临床上应用最广泛最为重要的抗凝剂。肝素和硫酸乙酰肝素(Heparan Sulfate，HS，可视为低硫酸化的肝素)普遍存在于哺乳动物组织中，在哺乳动物组织中的合成遵从相同的路线：首先在核心蛋白丝氨酸的-OH上引入半乳糖，然后在半乳糖上依次连接上-木糖-木糖，在第二个木糖上开始合成肝素和/或硫酸乙酰肝素的前体多糖：重复的-4)D-GlcA β(1-4)D-GlcNAcα(1-二糖单元；重复的二糖单元合成后，包括核心蛋白一起被转运到高尔基体，然后开始肝素和/或硫酸乙酰肝素的修饰过程：首先是在NDST酶的作用下GlcNAc的脱乙酰化和硫酸化，然后在C5差向异构酶的做用下D-GlcA转化为L-IdoA，并伴随L-IdoA的2-O硫酸化；然后是6位和3位的O-硫酸化。在肝素中有大约90％的GlcNAc被转化为N-硫酸根，硫酸乙酰肝素中的这一比例仅为40～50％；在成熟的肝素多糖链中，三硫酸化的GlcNS6S-IdoA2S二糖重复单元的含量不低于50％，硫酸乙酰肝素中这种三硫酸化的二糖重复单元的含量在10％以下。

现阶段各国药典均规定肝素的来源为哺乳动物小肠粘膜提取；小肠粘膜中提取的粗品肝素中除含有硫酸乙酰肝素外，通常还含有硫酸皮肤素(DS)和少量的硫酸软骨素(CS)。硫酸软骨素(CS)在乙醇沉淀中容易被去除。硫酸乙酰肝素(HS)和硫酸皮肤素(DS)通常被认为是肝素的次级组份，不易与肝素(HP)分离，其中HS在凝胶电泳中相对HP的迁移速率快，而被称为快移动肝素，采用常规的离子交换层析和有机溶剂分级沉淀的方法很难将三者分离。

目前可见的硫酸乙酰肝素(HS)分离纯化的方式主要有以下几种。

一、参见中国专利CN200610040707，该专利公开了一种肝素钠副产物中分离提纯硫酸皮肤素和低分子硫酸乙酰肝素的方法。该方法中，以粗品肝素经乙醇沉淀分级获得的DS和HS混合物为原料，通过亚硝酸盐或亚硝酸酯氧化，使混合物中的HS降解成小分子，然后再通过乙醇分级沉淀获得高纯度的DS和小分子HS。

二、参见中国专利CN201210424451，该专利公开了一种从肝素副产物中分离提纯肝素钠和硫酸乙酰肝素的方法。该方法中，以粗品HP经乙醇沉淀分级获得的DS和HS混合物为原料，将HP副产物溶解后加入醋酸钾使HP沉淀分离，沉淀溶解后再加入醋酸钾沉淀，收集沉淀，溶解后经过无水乙醇多次分级沉淀，进而制得纯度较高的HP；上清液通过加入班氏试剂和饱和氢氧化钠溶液，离心得到含有HS的溶液，以除铜剂除去铜离子，加入活性炭吸附沉淀并脱色后过滤，再通过阴离子交换树脂吸附和洗脱，分离得到高纯度的HS。

三、参见CN201810780264发明公布文件，该发明公布文件公开了一种从肝素生产废弃物中提取高纯硫酸乙酰肝素的方法。该方法中，以HP生产废弃物为原料进行提取纯化HS，将HP生产废弃物制成溶液，加入酸，调节pH至1.9-2.3，然后加入乙醇，搅拌，离心或静置；收集上清液，加碱溶液调节pH至6-8，再加水；向溶液中加入吸附剂，搅拌直到吸附剂吸附溶液中的粘多糖全部被吸附；收集吸附剂，清水清洗，加入氯化钠溶液洗脱，洗脱完成后收集洗脱液，加入沉淀剂进行沉淀；收集沉淀，加水溶解，加入氧化剂氧化；氧化后溶液加沉淀剂进行沉淀；收集沉淀为高纯的HS。