[发明专利]通用型病原微生物快速磁分离方法及试剂盒

说明书

本发明公开了一种通用型病原微生物快速磁分离方法：(1)制备通用桥连磁珠：a)制备磁珠‑链霉亲和素交联物；b)制备生物素‑Ab2交联物；c)制成通用桥连磁珠：将磁珠‑链霉亲和素交联物与生物素‑Ab2交联物混合孵育，制得通用桥连磁珠；(2)制备特异捕捉磁珠：将通用桥连磁珠与待测病原微生物的鼠源性Ab1混合，即可获得特异捕捉磁珠；(3)采用特异捕捉磁珠对待检测样品进行病原体捕捉分离纯化、初步鉴别。还公开了一种试剂盒，包括前述方法制备得到的特异捕捉磁珠。本发明实现了免疫磁珠制备的简易化、性能最优化、易实现自动化，通过分离操作即可获得单一目的菌，能够对样本中多种病原同步、自动化检测。

技术领域

本发明涉及体外生物检测诊断技术领域，具体涉及一种通用型病原微生物快速磁分离方法及试剂盒。

背景技术

病原微生物包括病毒、衣原体、立克次体、支原体、细菌、螺旋体、放线菌、真菌等八大类。病毒、衣原体、立克次体属寄生微生物，需在特定的活细胞内增殖；支原体、细菌、螺旋体、放线菌、真菌属独立生长微生物，可在无细胞培养基中繁殖，是微生物学检验的主要对象。

微生物学检测是判定病原感染、卫生状态的确证性方法，检测结果关乎临床选药及卫生决策。检测过程主要包括病原分离、鉴别、药敏试验三大环节。其中病原分离是基础，是后续检测的前提；病原鉴别是关键，可避免选药的盲目性；药敏性测试是目的，利于个性化精准用药。目前，病原鉴别、药敏测试已基本实现快速化、自动化，而病原分离仍以传统的划线分离培养法为主。

划线分离培养法是借助划线将标本中混杂的细菌在琼脂平皿表面分散开来，使单个菌能固定在某一点，经培养生长繁殖后形成单个菌落，以达到分离获得纯种菌的目的。本法耗时长(常需1-5天)、影响因素多，分离成功率低，分离菌株不代表目的菌总体。

随着磁分离免疫技术的应用，近年人们对病原菌的免疫磁珠分离方法进行的多种尝试，并得出以下结论：纳米级磁珠比微米级磁珠对病原菌的分离效果更好；可用病原特异的多克隆抗体或单克隆抗体偶联到磁珠表面制成免疫磁珠；可用直接法或用间接法将特异抗体与磁珠偶联；在生物素与抗体间增加长链物质，可解决抗体结合病原菌时的空间位阻问题。

但直至目前，通过免疫磁珠法分离病原菌仍未获得认可和普及，主要原因为：1)分离一种病原就需特制一种专用免疫磁珠，而免疫磁珠制备过程复杂、技术难度大、抗体活性在偶联过程中损失大、偶联抗体量不足，质量很难保证；2)病原分离的纯度仅达到“富集”水平，为获得纯目的菌仍需划线分离培养，既不省时也不省力，反而增加了检测成本；3)无法对样本进行多种病原的同步化、自动化分离。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种通用型病原微生物快速磁分离方法及试剂盒。

为了实现本发明目的本发明采用的技术方案是：

一种通用型病原微生物快速磁分离方法，包括如下步骤：

(1)制备通用桥连磁珠：

a)制备磁珠-链霉亲和素交联物：取粒径为10～50nm的羧基磁珠,活化后与链霉亲和素结合，并封闭残余活性基团。

b)制备生物素-Ab2交联物：取生物素进行活化，再与Ab2(二抗)偶联；或者，用商品化的水溶性生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯与Ab2直接偶联；Ab2如果选择使用抗血清，抗血清可先行辛酸-硫酸铵分离纯化并测定抗体蛋白含量。

c)制成通用桥连磁珠：将磁珠-链霉亲和素交联物与生物素-Ab2交联物混合孵育，制得通用桥连磁珠，洗涤去除游离的Ab2；因1个亲和素分子可结合4个生物素分子，间接连接了4个Ab2分子，实现了四倍放大效应。

(2)制备特异捕捉磁珠：将前面制备得到的通用桥连磁珠与待测病原微生物的鼠源性Ab1(一抗)混合，即可获得特异捕捉磁珠，洗涤去除游离Ab1。Ab1若为单抗腹水，需预先纯化并测定蛋白含量。