[发明专利]一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，其特征在于：含有hPGK和hUbC双启动子；含有T2A序列，T2A序列能使连接的两个基因同时表达；

酶切位点为XbaI、NdeI、SalI、BamHI、NsiI、PstI和KpnI；

所述用于制备 CAR-T 的慢病毒载体质粒的基因序列为 SEQ ID NO：3。

2.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，其特征在于：在双启动子及T2A序列的作用下，慢病毒载体质粒能够最多同时表达3个基因；该慢病毒载体质粒中携带并表达单个CAR基因、或多个CAR基因或含有CAR基因与其他基因，所述的其他基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。

3.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：

以Plenti PGK GFP Puro为起始载体，通过BamHI和KpnI酶切，切下含有hPGKpromoter、cPPT/CTS、RRE、5’-LTR、ori、Amp、3’-LTR组件的长片段Fragment 1，切胶回收，备用；

其中Fragment 1的基因序列为SEQ ID NO：1；

合成基因片段Fragment 2，基因片段Fragment 2中含有以下酶切位点或组件：BamHI、SalI、2A、NdeI、XbaI、WPRE、hUbC、NsiI、PstI、NsiI和KpnI；

Fragment 2的基因序列为SEQ ID NO：2；

BamHI和KpnI酶切Fragment 2，切胶回收，与步骤的切胶回收产物连接，连接产物转化Stbl3感受态，涂布平板，挑取单菌落至LB培养基中，培养10~15小时；

质粒小提，BamHI和KpnI酶切验证目的条带，大小为1.947kb，质粒测序验证，得到慢病毒载体pLC，大小为7.967 kb，pLC的基因序列为SEQ ID NO：3。

4.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在构建携带单个CAR基因的质粒中的应用。

5.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在构建携带多个CAR基因的质粒中的应用。

6.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在构建携带CAR基因和其它基因的质粒中的应用，其中其它基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。

7.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在制备用于CAR-T的慢病毒中的应用。

8.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的应用，其特征在于：在制备CAR-T细胞中的应用。