[发明专利]一种基因工程菌在制备甾体化合物中的应用

说明书

本发明提供一种基因工程菌在制备甾体化合物中的应用。所述基因工程菌是缺失了一种酰基辅酶A硫解酶基因的菌株，所述酰基辅酶A硫解酶基因编码如下蛋白质(A)或(B)：(A)具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；(B)与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少70％的同源性的氨基酸序列。本发明通过构建缺失酰基辅酶A硫解酶基因的基因工程菌，将其用于制备1，4‑BNA、4‑BNA、9‑OH‑BNA等甾体化合物，提高甾体药物的生产效率与产品品质，提高药物前体的利用率，降低生产成本，且反应条件温和、环境友好，具有较高的经济效益和社会效益。

本申请是申请日为2014年12月12日，中国申请号为“201480078679.4”(国际申请号为“PCT/CN2014/093667”)的“羟酰辅酶A脱氢酶基因和酰基辅酶A硫解酶基因，及其基因工程菌和应用”的分案申请。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地涉及一种基因工程菌在制备甾体化合物中的应用。

背景技术

甾体化合物又称类固醇，是一类以环戊烷多氢菲为母核，结构相似的化合物。其基本结构如下图所示，由三个六元环和一个五元环组成，分别称为A、B、C、D环，在母核的第10、13位有甲基，第3、11、17位可能有羟基、酮基或烷基，A、B、C与D环可有双键，17位上常有长短不同的侧链。由于甾体母核上取代基、双键位置或立体构型等的不同，形成了一系列具有独特生理功能的化合物。在人和动物体内，类固醇是主要的内源性激素，由性器官与肾上腺皮质所分泌，与生殖、大脑和骨骼的发育、稳态的维持及生物效应的调控等密切相关。同时作为外源激素，甾体激素类药物是临床上不可或缺的一类药物，对机体起着重要的调节作用，具有极其重要的医药价值，如肾上腺皮质激素具有抗炎症、抗过敏、抗变态、抗休克反应等功效。

如图1所示，羟酰辅酶A脱氢酶、酰基辅酶A硫解酶是参与分枝杆菌降解甾醇侧链的两个关键酶。结核分枝杆菌甾体代谢基因簇中对羟酰辅酶A脱氢酶的功能定义为17位的羟基甾体脱氢酶，因其与哺乳动物细胞的第IV型17β-羟基甾体脱氢酶N段功能结构域高度近似，故此得名。同时该酶还被报道具有3-羟基辅酶A脱氢酶的功能，但截至目前为止还没有得到证实。酰基辅酶A硫解酶参与甾醇侧链降解的硫解脱碳反应，类似于脂肪酸的β-氧化过程中的硫解反应。因为甾醇侧链降解过程是一个极其复杂的综合性酶促反应，所以这一降解过程的机制还有待进一步的发掘研究。

微生物转化作为甾体药物工业生产体系中的瓶颈环节，其落后的微生物制甾药工艺、高效菌株的开发、新建转化生产线的巨额开支等问题都严重制约着甾体医药产业的快速发展，同时也是甾体药物生产成本高昂的一个重要原因。我国甾体医药生产企业众多，产值巨大，针对当前一些重要的甾体微生物转化反应，成功进行高效生产菌株的改造与开发，必将受到产业界的欢迎，从而从整体上大大提升我国甾体医药产业的生产水平，其产生的经济效益将是十分可观的。

针对甾体医药工业生产体系中的重要微生物转化反应，通过基因工程技术改造，开发高效微生物转化反应，可大大提高甾体药物的生产效率与产品品质，有助于降低甾体药物生产过程中的能耗、提高药物前体的利用率、简化生产步骤，降低生产成本，从而有助于甾体药物价格的下降。此外，微生物转化反应条件温和、环境友好，属绿色化工技术，大力推广其在生产中的应用，是社会可持续性发展的必然要求。

发明内容

本发明的目的是提供一种基因工程菌在制备甾体化合物中的应用，从而解决现有技术中的甾体药物工业生产工艺复杂，效率低，成本高，继而导致甾体药物价格昂贵的缺陷。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面提供一种羟酰辅酶A脱氢酶基因，所述羟酰辅酶A脱氢酶基因编码如下蛋白质(ⅰ)或(ⅱ)：(ⅰ)具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；(ⅱ)在(ⅰ)限定的氨基酸序列中经过取代，缺失或者叠加一个或几个氨基酸衍生的蛋白质且与(ⅰ)的蛋白质具有相同的功能。