[发明专利]一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及疾病模型应用

说明书

本发明公开了一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及疾病模型应用，提供一种稳定传代并带有人源主动脉夹层特异性遗传信息的多能干细胞系，从而可获得体外细胞模型模拟患者的部分病理状态并研究疾病的发生发展过程的细胞及分子机制，本发明公开一种特异性诱导多能干细胞的制备方法，其方法利用episomal质粒电转方法将转录因子直接转入细胞，操作简便，节省时间，为体外疾病细胞模型的建立创造了良好的条件，进一步提供了由动脉夹层特异性诱导多能干细胞系定向分化为具有AD病人特异性遗传信息的平滑肌细胞，以建立一个稳定的体外平滑肌细胞AD疾病模型，以及在制备人主动脉夹层细胞模型中的应用，用以应用在AD相关病理机制研究以及个体化药物筛选。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，具体涉及到一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞及其制备方法和应用。

背景技术

主动脉夹层(aortic dissection，AD)是指由于多种自身或外界因素使主动脉内膜发生急性损伤，高速血流由撕裂口进入主动脉内膜与中膜之间，从而形成一个假腔，随着血液的不断流入，假腔会沿着主动脉纵轴快速延伸，严重者可进展到腹主动脉及髂总动脉，随着血液的灌入假腔内压力逐渐增加，最终会导致主动脉壁破裂。主动脉夹层是一种严重危及人类生命的心血管急症，其发病急剧，具有高发病率及病死率，若未及时救治，急性主动脉夹层发生后48h内，病死率高达50％～68％，3个月内病死率可达90％。流行病学研究显示发病率约为3-5/10万人每年(Nienaber，CA，et al.Nature reviews disease primers，2016(2)：1-17)。主动脉夹层的发病机制十分复杂，虽然免疫炎症、遗传因素、高血压、氧化应激等多个方面因素可能参与，但迄今为止，关于AD疾病发生的分子机制并未完全阐明。

目前，主动脉夹层的研究主要在动物水平上进行，由于种属差异，动物模型与人类在各种生理系统上存在很大差异，很多研究结果不能直接应用于人类疾病。因此，如何建立一个“人源性”体外细胞模型对于AD等心血管疾病的研究十分重要。

人诱导多能干细胞(human induced Pluripotent Stem Cells，hiPSCs)的出现为转化医学和再生医学提供了强大的动力和革命性的模式转变，也为人类遗传性疾病的机制研究提供大量细胞来源。hiPSCs具有无限自我更新能力和多能性，可以分化成为人体内任意一种细胞，如平滑肌细胞、心肌细胞等，因而被广泛地应用于心血管疾病的研究中，在疾病模型建立、疾病分子机制研究以及新药研发等方面具有巨大的潜在价值。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的提供一种稳定传代并带有人源主动脉夹层特异性遗传信息的多能干细胞系及其制备方法及应用。

为实现上述目的，本发明提供一种主动脉夹层特异性诱导多能干细胞的制备方法，包括以下步骤：

步骤一、采集人源性胸主动脉夹层手术丢弃的主动脉组织；

步骤二、将步骤一中的主动脉组织剪碎，经小组织块贴壁培养获得原代细胞；

步骤三、将含有OCT4、KLF4、SOX2、L-MYC、Lin28、shp53基因的4个episomal质粒经nucleofector电转入原代细胞，培养3-7天后将细胞转入预先铺有Matrigel的培养皿培养，加入重编程培养液隔天换液培养，在胚胎干细胞样克隆长出后用多能干细胞培养液(TeSRE8，stemcell technologies)，每天换液培养，挑取克隆扩增，建立动脉夹层iPSC细胞系。

本发明的人源性胸主动脉夹层手术丢弃的主动脉组织来源于温州医科大学第一附属医院的一例48岁男性主动脉夹层病患血管替换手术丢弃的主动脉组织。

在本发明的另一方面，提供一种上述制备方法制备的主动脉夹层特异性诱导多能干细胞系。