[发明专利]一种用于细胞内蛋白质复合物原位分析的载体及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及一种用于细胞内蛋白质复合物原位分析的载体及其制备方法和应用。所述的细胞内蛋白质复合物原位分析的载体,其作用在于将用于蛋白质复合物分析的化学交联剂，通过跨膜递送的方式，运送至细胞内特定部位，并且释放化学交联剂，从而使蛋白质复合物进行原位交联。并结合结合质谱技术，解析对细胞内蛋白质复合物进行时空动态变化规律的分析。这对于理解生命过程、揭示疾病机制、筛选生物标志物以及寻找药物靶标具有重大意义。

技术领域

本发明涉及一种用于细胞内蛋白质复合物原位分析的载体及其制备方法和应用。本发明属于功能性生物材料及其制备和在蛋白质复合物原位分析的应用。

背景技术

蛋白质复合物是蛋白质机器的重要组成部分。蛋白质复合物动态组装的高维度信号转导网络贯穿于不同亚细胞器，调控着几乎所有的生命过程。对复杂体系中蛋白质复合物进行时空动态变化规律的分析，并绘制相互作用网络，对于理解生命过程、揭示疾病机制、筛选生物标志物以及寻找药物靶标具有重大意义。

化学交联结合质谱技术(简称交联质谱技术或CXMS)，是近年发展起来的用于蛋白质复合物分析的新方法。它利用化学交联剂处理蛋白质样品，使蛋白质内部或不同蛋白质之间发生交联反应，实现对蛋白质中各个氨基酸侧链或官能团空间位置的定位，然后利用现代质谱技术鉴定氨基酸侧链或官能团，获得氨基酸或官能团的相对空间距离，构建蛋白质的空间结构及蛋白质复合物亚基的空间排列位置。与X-射线衍射、冷冻电镜、核磁共振等主流结构生物学研究技术相比，CXMS能够实现蛋白质复合物组成、相互作用界面信息的鉴定，并且具有分析通量高、灵敏度高的优势，且对样品的纯度要求低。因此，非常适合于复杂样品中蛋白质复合物的规模化精准解析。

随着质谱数据处理能力的快速发展，CXMS已成为解析蛋白质复合物的有力工具。利用该策略，现已实现了蛋白质磷酸酶2A复合物及线粒体核糖体等蛋白质复合物结构的精细解析(Science 2012,337(6100),1348-1352.)；结合CXMS与冷冻电镜技术，现已成功解析了RNA剪接体的精细结构(Science 2015,349(6253),1191-1198.)。该技术所具有的分析通量高、稳定性强、适用蛋白质范围宽等特点使其迅速成为主流结构生物学研究技术的有力补充。

交联质谱技术的核心是化学交联剂。近年来，化学交联剂种类增长十分迅速，出现了大量具有不同臂长、不同反应活性的化学交联剂。根据在蛋白质上的交联位置，大致可分为：胺类交联剂(例如：双琥珀酰亚胺辛二酸酯(DSS)，交联位置：赖氨酸(K)侧链的氨基或者蛋白质N端的氨基)、巯基交联剂(例如：顺丁烯二酸亚胺，交联位置：半胱氨酸的巯基)和非特异性交联剂(例如：双吖丙啶、重氮化合物、甲醛等，交联位置：所有氨基酸，无特异性)等类型。当前交联剂普遍具有高反应活性、极易水解的特点，较难穿过生物膜屏障，因此，亟需发展在细胞水平上可实现胞内蛋白质复合物原位交联方法，以满足细胞内蛋白质复合物原位结构解析的需求。

跨膜转运载体是指通过主动运输或者被动运输的方式，携带外界物质透过细胞膜输送至靶向部位的体系。在医药领域，跨膜靶向转运载体已经成功用于许多药物的给药系统。它增加了药物在细胞膜上的通透性，辅助药物克服酶等生物屏障，改善药物的体内药代动力学，从而增加药物在靶向位置的分布量，提高药物在体内释放的可控性，最终达到提高药效的目的。但是当前跨膜转运载体以在病灶部位缓释药物为主，还无法满足原位蛋白质复合物解析对化学交联剂载体的需求——在保持交联剂活性的情况下，高装载量和可控快速释放。

在本专利中，针对现有化学交联剂无法靶向输运而导致的细胞内蛋白质复合物的原位分析困难的问题，研制用于细胞内蛋白质复合物原位分析的载体，以实现亚细胞器上蛋白质复合物的时空动态分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于细胞内蛋白质复合物原位分析的载体及其制备方法和应用，通过本发明的用于细胞内蛋白质复合物原位分析的载体有效解决了交联剂活性强，副反应多的问题，此外还解决了细胞内蛋白质复合物的原位靶向分析困难的问题。