[发明专利]一种检测PD-L1和CD8抗原的免疫荧光试剂盒及应用方法

说明书

本发明涉及一种检测PD‑L1和CD8抗原的免疫荧光试剂盒及应用其的检测方法；所述的试剂盒包括以下试剂：缓冲液CYP1、CYP2、CYPP、封闭液、检测PD‑L1的特异性抗体以及相应的荧光二抗、荧光标记的CD45抗体、荧光标记的CD8抗体、抗体稀释液、细胞核染色液。本发明还提出应用所述的试剂盒进行抗原检测的方法。本发明的试剂盒检测结果可以对实际用药进行指导，不仅能够反映整体肿瘤,包括原位癌和可能存在的不可见的微小转移灶负荷，同样可以反映CTC中PD‑L1的表达情况；根据PBMC中PD‑L1和CD8阳性细胞比例，可以为治疗药物的精准选择提供参考；在取材上比基于肿瘤组织的检测技术更加方便。

技术领域

本发明涉及一种医学检测方法，尤其涉及体液中的癌细胞的检测和PBMC中免疫相关细胞的检测，具体涉及循环肿瘤细胞中程序性死亡配体(programmed death-ligand 1,PD-L1)抗原免疫荧光检测和PBMC中PD-L1和CD8比例检测的试剂盒，适用于不同类型样本PD-L1和CD8检测，还涉及该试剂盒在检测PD-L1和CD8中的应用方法。

背景技术

目前，癌症发病率较高，严重威胁人类健康。有些癌症较难早期发现，诊断时多为晚期，如肺癌，结直肠癌，卵巢癌，胰腺癌等。相应的，晚期癌症的5年存活率显著低于早期患者，早发现早诊断精准治疗可显著延长患者的存活时间。

共刺激分子是一类参与免疫反应的辅助分子，它既包括促进T细胞增殖的正性分子，也包括诱导和维持T细胞免疫耐受以至凋亡的负性分子。程序性死亡因子(programmeddeath-1，PD-1)与其配体PD-L1(programmed death-ligand 1，又称B7-H1)构成的共刺激途径对淋巴细胞的活化具有重要的调节功能，通过与受体PD-1结合抑制T细胞的增值和过度活化，在细胞免疫应答过程中起负调控作用，同时通过影响细胞因子的分泌对体液免疫也发挥了调控作用。PD-L1/PD1路径在机体自身免疫耐受和肿瘤细胞逃逸机体免疫监控过程中都发挥着重要作用。肿瘤细胞表面结构上相似于免疫球蛋白的分子B7-H1(又称PD-L1)，在肿瘤微环境中大量表达可抑制淋巴细胞对肿瘤的杀伤。用特异性抗体封闭PD-1/PD-L1结合可增强免疫反应，基于这个原理设计的用于阻断PD-1和PD-L1结合的抗体治疗(简称抗PD治疗)已经在成千上万的癌症病人身上使用，并证实，在十余种晚期癌症，包括肺癌、肾癌、黑色素瘤、头颈癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、食管癌、脑胶质瘤、结肠癌、何杰金氏淋巴瘤等有显著疗效，PD治疗是目前最有效的免疫治疗方法。

根据肿瘤组织微环境中浸润免疫细胞的有无或多少可以将其分为有免疫源性的肿瘤(immunogenic tumor，即热肿瘤)和无免疫源性的肿瘤(non-immunogenic tumor，即冷肿瘤)，研究认为在热肿瘤中存在免疫细胞，但由于肿瘤细胞PD-L1的表达抑制了T细胞的杀伤作用。采用免疫监测点抑制剂治疗，可解除免疫细胞的免疫抑制，使之能够对肿瘤细胞进行杀伤。对这类患者，单独使用PD-1/PD-L1抗体的有效率较高，生存期更长。而对那些肿瘤组织中没有或者只有很少免疫细胞的“冷”肿瘤患者，免疫监测点抑制剂的疗效不佳，即使封闭了肿瘤细胞上PD-L1分子，也因为缺少相应的免疫细胞而不能对肿瘤组织进行有效的杀伤，需要联合其他治疗方可使免疫细胞聚集于肿瘤组织中。