[发明专利]可视化紫根报告基因载体构建及其应用

说明书

本发明公开一种AtMYB75基因在植物中作为可视化紫根报告基因的应用，将所述基因转化紫花大豆品种、蒺藜苜蓿或百脉根中可产生肉眼可见的紫色根，因而能够作为报告基因，其具有不需要破坏植物器官，也不需要借助光学仪器即可见的的优点，具有明显的应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域。具体涉及一种适用于作为植物毛状根转化过程中转基因根的报告基因，更具体涉及可视化紫根报告基因。

背景技术

植物转基因过程中，在载体中通常需要加入报告基因，以确定是转基因植株/器官/细胞。目前常用的报告基因有氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、荧光素酶基因(luc)、β-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、分泌型碱性磷酸酶基因(seap)、绿色荧光蛋白基因(gfp)、红色荧光蛋白基因（rfp）等。

自从Jefferson首次提出β-D-葡萄糖苷酶基因可作为植物遗传转化时的报告基因以来，目前已成为一种最广泛运用的报告基因。该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。其优点是检测方法简单，灵敏度高。根据gus基因检测所用的底物不同，可以选择三种检测方法：组织化学法、分光光度法和荧光法。其中最为常用的是组织化学法。组织化学法检测以5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸（X-Gluc）作为反应底物，将被检材料用含有底物的缓冲液浸泡。若组织细胞发生了gus基因的转化，并表达出GUS，在适宜的条件下，该酶就可将X-Gluc水解生成蓝色产物。这是由其初始产物经氧化二聚作用形成的靛蓝染料，它使具GUS活性的部位或位点呈现蓝色，用肉眼或在显微镜下可看到，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。因此利用该方法可观察到外源基因在特定器官、组织，甚至单个细胞内的表达情况。

荧光蛋白家族：荧光蛋白家族是从水螅纲和珊瑚类动物中发现的相对分子质量为20 000～30 000的同源蛋白。绿色荧光蛋白(GFP）是应用最多的发光蛋白。GFP存在于发光水母（AequoreaVictoria）中。用395 Bin的紫外线和475 nm的蓝光激发，GFP可在508nm处自行发射绿色荧光，无需辅助因子和底物。GFP最大的优势是无需损伤细胞即可研究细胞内事件。1991年克隆了GFP基因，已获得几个突变体，如“红色迁移”突变体（red—shiftmutant），其荧光更强。其他突变体还有蓝色荧光蛋白（BFP）、增强型GFP(EGFP）等。红色荧光蛋白（RFP）是从珊瑚（Discosoma sp．）中分离的发光蛋白（drFP583或DsRed），可发射明亮的红色荧光。这些常用的报告基因也可被联合应用，同时检测2个甚至3个基因的表达。

目前植物转基因的表达载体或CRISPR/Cas9基因编辑载体通常使用gus、rfp、gfp等报告基因或不使用报告基因。如使用最为广泛的遗传转化表达载体pCAMBIA1305.1使用GUSplus基因作为报告基因；pHairyRed表达载体使用红色荧光蛋白基因DsRed2作为报告基因（Meng-Han Lin, Peter M. Gresshoff, Arief Indrasumunar and Brett J.Ferguson. pHairyRed: A Novel Binary Vector Containing the DsRed2 ReporterGene for Visual Selection of Transgenic Hairy Roots.Molecular Plant, 2011,4:537–545）。其中，GUS作为报告基因有不足之处，一是GUS试剂花费高；二是GUS染色具有破坏性，直接将活体细胞杀死。而荧光蛋白基因作为报告基因在使用中不足在于，一是部分生物体有本底荧光表达，影响了其使用范围（Davis S J , Vierstra R D . Soluble, highlyfluorescent variants of green fluorescent protein (GFP) for use in higherplants[J]. Plant Molecular Biology, 1998, 36(4):521-528.）；二是荧光蛋白的检测必须使用专门的荧光检测仪器。