[发明专利]一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法在审
| 申请号： | 201910498532.5 | 申请日： | 2019-06-10 |
| 公开（公告）号： | CN110373392A | 公开（公告）日： | 2019-10-25 |
| 发明（设计）人： | 魏红江;赵恒;赵红业;角德灵;徐凯祥;郭建雄 | 申请（专利权）人： | 云南农业大学 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/877;A01K67/027 |
| 代理公司： | 北京名华博信知识产权代理有限公司 11453 | 代理人： | 李中强 |
| 地址： | 650201 云南省昆*** | 国省代码： | 云南;53 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 供体猪 异种移植 肾脏 构建 修饰基因 肾脏移植 体细胞核移植技术 猪胎儿成纤维细胞 动物生物技术 个人源化 功能验证 基因修饰 理论基础 移植治疗 多基因 基因 供体 敲除 修饰 开发 | ||
1.一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法，其特征在于：具体步骤为：
1）除引起抗原抗体免疫排斥反应的三个主要抗原基因
在猪成纤维细胞系的基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术同时敲除能够引起抗原抗体免疫排斥反应的GGTA1、CMAH、B4GalNT2三个抗原特异基因；
2）定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因
在前期获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO三基因修饰的基础上，再定点插入hCD55、hCD59、hCD46三个人源化修饰基因，获得GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因修饰基础供体猪；
3）体细胞核移植和胚胎移植
利用体细胞核移植技术，将经筛选获得的GTKO/CMAHKO/B4GalNT2KO/hCD55/hCD59/hCD46六基因细胞系进行体细胞核移植，待妊娠时取出胎儿鉴定基因的编辑情况，分离培养获得六基因修饰基础猪胎儿猪成纤维细胞系；
4）在此基础猪胎儿成纤维细胞的基础上，再定点插入hCD39、hTBM、REN三个特异修饰基因，构建出多基因修饰的肾脏异种移植供体猪；
5）对上述所获得的多基因修饰的肾脏异种移植供体猪进行功能验证，获得适合肾脏异种移植的供体猪。
2.根据权利要求1所述的一种适合肾脏异种移植供体猪的构建方法，其特征在于：步骤5）中，功能验证包括人血清介导的细胞毒性实验、人补体介导的细胞毒性实验、补体激活实验、抗原抗体结合分析、细胞免疫组化分析、凝血相关检测和淋巴细胞活性检测。
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