[发明专利]从肿瘤组织检测ALK基因融合变异的方法及其试剂盒

权利要求书

1.一种从肿瘤组织检测ALK基因融合变异的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

步骤1：从肿瘤组织获得RNA样本；

步骤2：在ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端的至少二个相邻外显子区域和参照基因mRNA中分别筛选待测靶标区域；

步骤3：对步骤2中筛选的靶标区域分别设计相应的引物对和探针，其中ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端外显子区的上游引物和下游引物分别位于待扩增测靶标区域的两端，所述上游引物、下游引物和/或探针的部分序列跨所述二个相邻外显子拼接区域，使上下游引物之间的待扩增测靶标区域至少包括一个所述二个相邻外显子拼接区域；所述ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端外显子区的的探针和所述参照基因的探针分别用不同的荧光基团进行标记；

步骤4：对步骤2中所述筛选的待测靶标区域进行微滴式数字PCR扩增；和

步骤5：根据所述ALK基因mRNA断裂位置之前的5’端和之后的3'端外显子区的和所述参照基因的不同荧光染料标记的阳性PCR产物液滴数的比例，来判断肿瘤组织是否存在ALK基因融合变异。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中设计ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物对和探针时，引物和探针的位置可以在20外显子之后的区域；ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端外显子区的引物对和探针时，引物和探针的位置可以在20外显子之前的区域。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中设计ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物和探针时，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子23，下游引物位于ALK基因外显子24，所述探针位于ALK基因外显子23-24拼接区域。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ALK基因上游引物为SEQ ID NO：1：TCTGAACAGGACGAACTGGA；所述ALK基因下游引物为SEQ ID NO：2：TGGTGGTTGAATTTGCTGA；和所述ALK基因探针为SEQ ID NO：9：CTCATGGAAGCCC。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中设计ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物和探针时，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子24，下游引物位于ALK基因外显子25，所述探针位于ALK基因外显子24-25拼接区域。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述ALK基因上游引物为SEQ ID NO：3：TCAGTATTTGGAGGAAAACCACT；所述ALK基因下游引物为SEQ ID NO：4：CCCAGAGGCCTTCATGGA；和所述ALK基因探针为SEQ ID NO：10：TGGCAGCAATGTCT。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中设计ALK基因mRNA断裂位置之后的3'端外显子区的引物和探针时，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子26，下游引物位于ALK基因外显子27，所述探针位于ALK基因外显子26-27拼接区域。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ALK基因上游引物为SEQ ID NO：5：TGGACAGGTCAAGAGGCA；所述ALK基因下游引物为SEQ ID NO：6：CCATAGCAGCACTCCAAAG；和所述ALK基因探针为SEQ ID NO：11：CATGTGTCTGTTTTAGAAG。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3中设计ALK基因mRNA断裂位置之前的5'端外显子区的的引物对和探针时，其中ALK基因上游引物位于ALK基因外显子17，下游引物位于ALK基因外显子18，所述探针位于ALK基因外显子17-18拼接区域。