[发明专利]一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体及其应用在审
| 申请号： | 201910491238.1 | 申请日： | 2019-06-06 |
| 公开（公告）号： | CN110257419A | 公开（公告）日： | 2019-09-20 |
| 发明（设计）人： | 杨顺瑛;苏彦华 | 申请（专利权）人： | 中国科学院南京土壤研究所 |
| 主分类号： | C12N15/82 | 分类号： | C12N15/82;A01H5/00;A01H6/20 |
| 代理公司： | 南京经纬专利商标代理有限公司 32200 | 代理人： | 唐循文 |
| 地址： | 210008 江*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 超表达载体 转运体基因 代谢基因 基因串联 氮素 体内 根系吸收 协同增效 植株 植物氮 铵态氮 同化 吸收 应用 串联 组装 积累 | ||
1.一种提高氮素利用效率的基因串联超表达载体，其特征在于所述载体上串联的基因为铵转运体基因和铵代谢基因。
2.根据权利要求1所述提高氮素利用效率的基因串联超表达载体，其特征在于所述铵转运体基因的多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述铵代谢基因的多核苷酸序列如SEQID NO.2所示。
3.权利要求1或2所述提高氮素利用效率的基因串联超表达载体在提高植物氮素利用效率中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤为：
a.提取水稻根系总RNA并以其为模板，以Oligo(dT)18为引物反转录，得到反转录产物cDNA；以此cDNA为模板，以SEQ ID NO.3所示的特异引物OsAMT1.1-KpnI-P1和SEQ ID NO.4所示的OsAMT1.1-XbaI-P2进行PCR扩增，得OsAMT1；1基因克隆；
b.将OsAMT1；1基因构建到pCambia2301-35s-nos上，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos表达载体；
c.以pCambia2301-35s-nos质粒为模板，以SEQ ID NO.5所示的特异引物35S-nos-HindIII-P1和SEQ ID NO.6所示的特异引物35S-nos-BstEII-P2进行PCR扩增得35S-NOS克隆；将35S-NOS克隆与pEASY-Blunt-Zero Vector(pEASY)连接转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得pEASY-35s-nos的重组质粒；
d.同步骤a，以SEQ ID NO.7所示的特异引物OsGS1；2-KpnI-P1和SEQ ID NO.8所示的OsGS1；2-BamHI-P2进行PCR扩增，得OsGS1；2基因克隆；将OSGS1；2基因经KpnI/BamHI酶切并构建到上述pEASY-35s-nos重组质粒中，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，得pEASY-35s-OsGS1；2-NOS阳性重组质粒；
e.用HindIII/BstEII将上述pEASY-35s-OsGS1；2-NOS阳性重组质粒的35s-OsGS1；2-NOS片段酶切并连接到pCambia2301-35s-OsAMT1；1-nos表达载体中，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos重组载体；
f.将pCambia2301-35s-OsAMT1；1+OsGS1；2-nos重组载体侵染野生型拟南芥的花絮，在含50μg/mL卡那霉素的1/2MS平板上筛选得抗性纯系苗。
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