[发明专利]一种基于阴离子多聚物修饰基质的细胞外囊泡分离富集方法

说明书

本发明公开了一种简易、低成本和通用性好的细胞外囊泡分离富集方法，其核心是通过静电相互作用实现对培养基、血浆、血清、尿液、唾液、乳液、胸腔积液和脑脊液等样本类型中细胞外囊泡的分离富集。该方法的实现方式为利用阴离子聚合物修饰基质材料在酸性条件下实现对细胞外囊泡的捕获，而在中性或者碱性条件下实现对前一步捕获细胞外囊泡的洗脱，最终达到分离富集细胞外囊泡的目的。该方法相较于现有细胞外囊泡分离富集方法具有分离过程简易、成本低、通用性好和与下游检测兼容性强的优点。

技术领域

本发明属于体外诊断及靶向载药领域，具体涉及一种细胞外囊泡分离富集方法。

背景技术

细胞外囊泡是一类由细胞分泌到细胞外空间的由磷脂双分子膜包裹的颗粒物，其直径在30nm～2000nm之间。其作为一种细胞间通讯载体广泛地分布于人体体液如血液、尿液、胸腔积液、唾液、腹水、乳液、鼻涕和脑脊液等当中^2,3。有大量的研究证明，细胞外囊泡携带有各种蛋白、脂质、DNA、mRNA、microRNA和non-coding RNA等效应物分子，其通过这些效应物分子与邻近细胞及远端细胞实现信息的沟通和物质的交换^1,4-6。近年来，越来越多的研究证实，细胞外囊泡在肿瘤发生发展中发挥非常重要作用,其既可以参与通过重构细胞外基质增进肿瘤细胞的侵染能力，又可以通过刺激内皮细胞促进周围血管的形成，还可以通过抑制免疫细胞而逃逸免疫细胞的杀伤^7,8。David Lyden等人甚至发现胰腺导管腺癌分泌的细胞外囊泡能够在远端肝脏处诱发形成预转移灶⁹。另外有研究证明，细胞外囊泡有靶向载药的潜力和低的免疫排异反应的特点，其被认为是一种具有价值的靶向给药载体。随着对细胞外囊泡研究的一步步加深，人们越来越意识到细胞外囊泡在肿瘤诊断和靶向载药领域丰富的内涵和巨大的价值^10,11。然而目前主流的细胞外囊泡分离方法复杂、纯度低、成本高和效率低等不足严重地阻碍了其在临床当中的推广和在学术研究中的拓展¹²。因此，临床实践和学术研究呼唤一种操作简单、通用性强、效率高和成本低的细胞外囊泡的分离富集技术。细胞外囊囊泡的亚型众多，如何有效地分类分离细胞外囊泡是细胞外囊泡研究的另外一大瓶颈。

目前，用于细胞外囊泡分离富集的方法主要有超速离心法、超微过滤法和免疫亲和捕获法等三大类。超速离心法被广泛应用到细胞外囊泡的分离当中，但是分离过程需要大型的超速离心机，大量杂蛋白和核酸被不可避免的共分离进而导致分离得到的细胞外囊泡纯度低，细胞外囊泡大小和密度的差异容易导致一些密度较低粒径较小的细胞外囊泡被丢弃，以及过高的离心力导致细胞外囊泡不可避免地损伤等一系列问题¹³。超微过滤法虽然能够分离得到纯度较高的细胞外囊泡，对设备的要求也相对简单，但是由于堵塞问题导致样品的捕获容量较小，又容易因剪切力导致细胞外囊泡不可避免的损伤，以及容易粘附在滤膜上进而导致分离效率降低¹³。免疫亲和捕获的方式具有分离效率高和特异性强的优势，但是有试剂成本高、捕获容量小和通用性差的不足。本发明涉及一种细胞外囊泡的非免疫的亲和分离方法，基于静电相互作用，依赖于修饰了阴离子多聚物基质，具有操作简单、成本低廉、通用性强和与下游检测兼容性强的特点。

文献引用：

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