[发明专利]一种同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体及重组细胞

说明书

本发明公开了一种同时定点整合FAD3和FABP4基因的载体及重组细胞，利用电穿孔的方法将靶向Rosa26基因的Cas9切割载体和打靶载体共转染鲁西黄牛胎儿成纤维细胞，实现将FAD3和FABP4基因同时定点插入到鲁西黄牛胎儿成纤维细胞基因组中；通过Junction PCR筛选和验证获得了打靶阳性克隆细胞；以本发明定点插入外源基因的阳性细胞为供核细胞移入去核的牛成熟卵母细胞中，获得转基因克隆胚胎，进一步将克隆胚胎移植到受体牛体内，可获得所期望的转基因牛。本发明为快速、高效研制优质转基因肉牛育种新材料提供了供核细胞和技术方法。

技术领域

本发明涉及转基因克隆动物技术领域，更具体的说是涉及一种基于CRISPR/Cas9介导的同时定点整合FAD3基因和FABP4基因的载体及重组细胞。

背景技术

脂肪酸脱氢酶(Fatty Acid Desaturase，FAD)是催化饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸链上特定的位置形成双键的酶类，它是多不饱和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids，PUFA)合成途径的关键酶。其中FAD3基因是植物中的一种多不饱和脂肪酸去饱和酶基因，属于ω-3型多不饱和脂肪酸脱氢酶，该酶以ω-6多不饱和脂肪酸为优先底物，使其脱氧转化为ω-3多不饱和脂肪酸。ω-3多不饱和脂肪酸是组成人体必需的物质，对健康非常重要，ω-6与ω-3PUFA比值过高可导致心血管疾病、癌症、炎症以及自身免疫反应等疾病，并且对于新生儿及幼儿的大脑、中枢神经和免疫系统的发育起重要作用。总之，FAD3基因是一种能有效将自身ω-6PUFAs转化为ω-3PUFAs的多不饱和脂肪酸去饱和酶基因，其可以作为改善脂肪酸比例的理想酶基因。

脂肪酸结合蛋白4(adipose fatty acid-binding protein，FABP4)，又可称为A-FABP，是组织特异性脂肪酸结合蛋白家族FABPs(fatty acid binding proteins)的重要成员之一，参与脂类代谢和脂肪沉积的调控，并在长链脂肪酸的摄取、转运以及能量代谢和炎症反应中起着重要的调控作用。其占细胞总蛋白量约为6％，主要在脂肪组织中表达量较高，因此是成熟脂肪细胞中重要的胞质蛋白之一。已有研究表明，FABP4与脂质代谢紊乱、糖尿病和肥胖相关。在脂肪细胞分化过程中，FABP4 mRNA表达水平显著升高，并且会受到脂肪酸、PPARγ激动剂及胰岛素的调控。在脂肪酸沉积和降解过程中，FABP4表达水平的提高可促进脂肪的沉积和脂解效率降低。FABP4作为一种脂质蛋白伴侣，对长链脂肪酸具有高亲和力，说明FABP4可优先结合长链脂肪酸，促进长链脂肪酸的吸收和降解。因此，FABP4影响脂肪酸的摄取、转运、酯化和β-氧化，调节体内能量平衡和脂质信号转导，也是影响牛肉嫩度和增加肌内脂肪含量的候选基因。

CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats/CRISPR-associated nuclease 9)系统是一种后天免疫防御系统，用以保护细菌或古细菌免受外来质粒或噬菌体的侵入。CRISPR/Cas9系统可以实现DNA片段的删除、反转、重复、插入和易位等基因编辑，也可用于功能基因筛选、转录调控、表观遗传调控和标记成像等科研领域。其基因编辑的大致原理为：首先，sgRNA引导Cas9蛋白靶向DNA序列，对其进行识别并且切割，从而形成DNA双链断裂切口(double-strand break，DSB)；然后，细胞的自我修复过程启动，即通过非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)和同源重组(homology-directed repair，HDR)两种途径，对DSB进行修复。由于NHEJ修复会造成开放阅读框的位点缺失或插入，从而导致移码突变，完成对生物体DNA序列进行删除、添加、替换的编辑工作，效率较高；HDR修复过程需要同源模板用来重组断裂的DNA序列，达到条件性基因敲除、敲进、替换、点突变等工作，效率低但保真性高。