[发明专利]一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4及其应用

权利要求书

1.一种Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4，其特征在于，所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4，其特征在于，编码所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种表达权利要求1或2所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4的重组载体。

4.权利要求3所述重组载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以SEQ ID NO.3～60所示的引物组进行第一轮PCR扩增，得第一轮PCR产物；所述第一轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH₂O 28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL；

(2)以所述第一轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.60所示引物为引物对进行第二轮PCR扩增，得P2407A片段；所述第二轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH₂O 35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO.3所示引物0.5μL，SEQ ID NO.60所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第一轮PCR产物2μL；

(3)以SEQ ID NO.61～106所示的引物组进行第三轮PCR扩增，得第三轮PCR产物；所述第三轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH₂O 28.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，引物混合物10μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL；

(4)以所述第三轮PCR产物为模板，以SEQ ID NO.61和SEQ ID NO.106为引物对进行第四轮PCR扩增，得P2407B片段；所述第四轮PCR扩增的体系每50μL中包括：ddH₂O 35.5μL，5×PCR Buffer 10μL，dNTP 1μL，SEQ ID NO.61所示引物0.5μL，SEQ ID NO.106所示引物0.5μL，Pfu高保真DNA聚合酶0.5μL，第三轮PCR产物2μL；

(5)将所述P2407A片段和所述P2407B片段与pcDNA3.4质粒连接，得重组载体；

步骤(1)和步骤(3)之间不存在时间上的先后关系。

5.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤(1)所述第一轮PCR扩增和步骤(3)所述第三轮PCR扩增的程序独立的为95℃预变性3min；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸40s，25个循环；72℃延伸3min。

6.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤(2)所述第二轮PCR扩增和步骤(4)所述第四轮PCR扩增的程序独立的为95℃预变性3min；95℃变性25s，60℃退火20s，72℃延伸1min，25个循环；72℃延伸5min。

7.根据权利要求4所述构建方法，其特征在于，步骤(5)所述连接前，还包括对所述pcDNA3.4质粒进行线性化处理，所述线性化处理为利用NotI和XbaI双酶切。

8.一种包含权利要求1或2所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4或权利要求3所述重组载体或利用权利要求4～7任一项所述构建方法构建得到的重组载体的表达细胞。

9.权利要求1或2所述Fc融合蛋白FGFR1-MIP3a-CTLA4或权利要求3所述重组载体或利用权利要求4～7任一项所述构建方法构建得到的重组载体或权利要求8所述表达细胞在制备具有多重抗癌功效药物中的应用。

10.根据权利要求9所述应用，其特征在于，所述多重抗癌功效为靶向诱导特异性抗肿瘤免疫反应和抑制肿瘤血管生成。