[发明专利]鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法及应用

权利要求书

1.一种鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，所述鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法包括：

第一步，细胞凋亡检测，采用膜联蛋白V-FITC /碘化丙啶试验测定细胞凋亡；

第二步，Hoechst 33258染色，检测凋亡细胞的形态学评估；

第三步，吖啶橙/溴化乙锭染色，进行细胞死亡检测；

第四步，线粒体膜电位染色，采用JC-1检测试剂盒检测线粒体膜电位的变化；

第五步，活性氧种类测定，通过2,7-二氯荧光素二乙酸酯氧化敏感性荧光探针评估ROS的产生；

第六步，实时荧光定量PCR分析，使用TRIzol试剂从细胞中提取总RNA，使用逆转录试剂盒逆转录获得cDNA，随后进行PCR反应；

第七步，蛋白质印迹分析，并通过Image J软件对目的蛋白条带进行灰度分析；

第八步，统计分析，使用t检验进行数据组之间的差异检测。

2.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第一步， 细胞凋亡检测包括：用0,15,25,35 μg/ mL不同浓度的鸡骨香挥发油处理A549细胞48小时；将细胞消化并重悬浮于膜联蛋白V-FITC结合缓冲液中，加入膜联蛋白V-FITC和PI试剂，并在室温下避光孵育；通过流式细胞术检测染色的细胞。

3.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第二步，Hoechst 33258染色包括：将细胞接种在12孔板中用0,15,25,35 μg/ mL不同浓度的鸡骨香挥发油处理细胞48小时；将细胞用4％多聚甲醛固定15分钟；用PBS洗涤两次后，用Hoechst 33258将细胞染色；并分析细胞核的形态变化。

4.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第三步，吖啶橙/溴化乙锭染色包括：

将A549细胞接种在12孔培养板中；并用含有0,15,25,35 μg/ mL不同浓度鸡骨香挥发油处理48小时后，将1mL、浓度100 μg/ mL 的AO / EB染色加入到每个孔中，避光孵育，检测染色的细胞。

5.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第四步，线粒体膜电位染色包括：

细胞接种在6孔板用0 μg/mL、15 μg/mL、25 μg/mL和35 μg/mL鸡骨香挥发油处理细胞48小时，加入JC-1试剂，并检测结果。

6.如权利要求1所述的鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法，其特征在于，第五步，活性氧种类测定包括：接种在6孔板用0, 15 μg/mL,25 μg/mL和35 μg/mL鸡骨香挥发油处理细胞48小时；加入MDCFH-DA试剂温育30分钟；用荧光分光光度计检测细胞内DCF的荧光，激发= 488 nm；发射=521 nm；

第六步，实时荧光定量PCR分析包括：使用SYBR Premix ExTaq II在AppliedBiosystems 7500实时PCR系统上进行qPCR；

第七步，蛋白质印迹分析包括：用CCEO处理后收集细胞，并在含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解；将40-60 μg目的蛋白上样于10-12％SDS-PAGE胶中进行电泳后并转移至PVDF膜；将膜于5％脱脂牛奶中在室温下封闭1小时；然后，将膜与特定目标抗体一起孵育4°C过夜，用TBST洗涤，然后与HRP偶联的二抗在室温下孵育2小时，随后将ECL发光剂混合液加入到PDVF膜上，在化学发光成像系统中进行扫膜显影。

7.一种利用权利要求1所述鸡骨香挥发油抗肿瘤活性及其相关机制的测试方法测定的鸡骨香挥发油。