[发明专利]一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法

说明书

本发明属于病毒筛选技术领域，公开了一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法，包括以下步骤：收集并处理病死鸭的肝脏病料；将肝脏病料接种于SPF鸭胚，收获死亡鸭胚液及胚体，传代培养得到待筛选的鸭肝炎病毒毒株；将上述毒株稀释后接种于SPF鸭胚，筛选出第一轮病毒毒株；用第一轮病毒毒株制备雏鸭毒，将雏鸭毒稀释后接种于雏鸭，筛选出第二轮病毒毒株；用第二轮病毒毒株制备灭火疫苗，免疫SPF鸡，筛选出第三轮病毒毒株；用第三轮病毒毒株制备的阳性血清注射于所述发病鸭场内的发病鸭，最终确定鸭肝炎病毒毒种。该方法可高效地筛选出优质的鸭肝炎病毒毒种，能够缩短疫苗产品的更新换代的时间，为市场上鸭病毒性肝炎的流行提供及时有效的治疗产品。

技术领域

本发明属于病毒筛选技术领域，涉及一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法。

背景技术

鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis，DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck HepatitisVirus，DHV)引起的雏鸭的一种急性、烈性、高死亡率、高度接触性传染病，主要特征为发病急、传播快、死亡率高，常发生于3周龄以下的雏鸭，成年鸭不见发病，尤其是不足1周龄的雏鸭最易感染，发病率高达100％，一旦发病，死亡率可达90％以上，对我国养鸭业的发展危害重大。临床表现为角弓反张，病理变化为肝炎，传染源为病鸭和带毒禽，可通过消化道、呼吸道传染，尚未证实经卵传播，一年四季均可发生，主要发生于孵化雏鸭的季节，严重威胁我国养鸭业的发展。

鸭病毒性肝炎的病原分I型、II型、III型和N-DHV四个血清型，这几种血清型相互独立，且无交叉保护性，但是所引起的病理变化、临床症状却很相似。I型属于小RNA病毒科未确定种病毒，可在鸭、鸡、鹅胚尿囊腔增殖，病毒抵抗力强，在自然环境中可较长时间存活。II型属于星状病毒，仅报道于英国。III型属于小RNA病毒肠病毒属。N-DHV同I型属于微RNA病毒科的一个新属，可能为Ⅰ型变异株。

鸭病毒性肝炎由于血清型复杂，相互之间没有交叉免疫保护，给鸭病毒性肝炎的预防和控制带来诸多不便。目前除采取常规卫生防疫措施外，常采用疫苗、高免血清或卵黄抗体等进行防治。但是，疫苗对于雏鸭免疫效果差，免疫成年鸭后，雏鸭的母源抗体又会干扰雏鸭的免疫效果；高免血清用量大、成本高、质量低等，在生产使用中受到一定限制。鸭病毒性肝炎卵蛋黄抗体在养鸭生产上已被广泛应用，它弥补了高免血清和疫苗的不足，且冻干制剂便于运输和保存、有效期长、副作用小、无残留、效果显著，在鸭病毒性肝炎的紧急预防及治疗方面发挥重要作用。以上三种防疫措施均需要从制备疫苗或抗体的病毒毒株入手，故从众多毒株中筛选出繁殖性能好、交叉保护率高、免疫原性佳的鸭肝炎病毒，是亟待解决的问题。

然而，由于市场流行毒株的血清型多样，毒株变异较快，经典的鸭肝炎病毒毒株已很难100％的保护各个地区鸭病毒性肝炎的流行。一个流行毒株的筛选，一般要经过病料采集、病毒分离与纯化、病毒理化和生物学特性验证等一系列过程，该过程不仅耗费时间长，而且需要大量的人力、物力，且筛选出的毒株不一定适合作为病毒种子。因此，急需一种能够高效筛选鸭肝炎病毒毒株的方法。

发明内容

本发明的目的在于针对常规方法筛选毒株耗时长、成本高、步骤复杂、结果难以判定等问题，提供一种省时、高效、实用的筛选鸭肝炎病毒毒株的方法。

为实现上述目的，本发明提供一种高效筛选鸭肝炎病毒毒种的方法，包括以下步骤。

步骤1：收集并处理多个地区病死鸭的肝脏病料；

步骤2：将步骤1获得的肝脏病料经尿囊腔接种于SPF鸭胚，收获死亡鸭胚液及胚体，进行连续传代培养，得到待筛选的鸭肝炎病毒毒株；

步骤3：将步骤2获得的待筛选的鸭肝炎病毒毒株进行系列稀释后经尿囊腔接种于SPF鸭胚，统计死鸭胚数量，根据计算的鸭胚半数致死量ELD₅₀，筛选48～120h死亡率大于80％、且病毒含量大于105.5ELD₅₀/0.1mL的鸭肝炎病毒毒株为第一轮鸭肝炎病毒毒株；