[发明专利]区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法及试剂盒

说明书

区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法及试剂盒，属于病毒检测领域。本发明以NP蛋白为免疫抗原，以单克隆抗体为抗体诊断试剂，利用棋盘法对包被抗原及单抗浓度进行优化，对包被时间、一抗浓度及孵育时间、二抗浓度及孵育时间等条件优化；根据工作浓度将免疫抗原包被于ELISA孔中，同时以不同稀释倍数的样本血清与固定稀释倍数的单克隆抗体混合后进行阻断实验，将混合物与固相抗原结合作用，再以辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG为二抗继续孵育，用TMB显色液显色，加入2M硫酸溶液终止反应。本发明可有效移除传染源，消灭持久疫源地的存在，为新城疫的净化提供理论依据，具有检测灵敏、准确，操作简便及特异性强的优点。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法及试剂盒。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种急性烈性高度接触性传染病，被世界动物卫生组织(OIE)列为必报动物疫病，我国农业部将其列为一类动物疫病，同时也是我国中长期规划五大优先防治的动物疫病之一。新城疫在世界范围内经过四次大流行，宿主范围不断扩大，迄今能自然或人工感染的禽类已超过250多种，对养殖业造成重大危害。虽然基因II型弱毒疫苗Lasota株能够有效的预防新城疫，但却无法区分疫苗抗体与野毒抗体，导致新城疫净化困难重重。农业部印发的《国家新城疫防治指导意见(2017-2020年)》中明确提出，到2020年底国家新城疫达到净化标准。因此，研发安全、高效的新型疫苗以及建立相匹配的能有效区分疫苗抗体与野毒抗体的检测方法成为目前的首要任务。

新城疫病毒属于副黏病毒科，禽腮腺炎病毒属，单股负链不分节段RNA病毒。新城疫共编码6种结构蛋白，依次为核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)、大分子蛋白(L)，而M蛋白是形成病毒样颗粒(virus-likeparticles，VLPs)的主要结构，在出芽过程中可自行组装HN蛋白和F蛋白。

新城疫病毒样颗粒(Newcastle disease virus-like particles，NDVVLPs)是由新城疫病毒的一个或多个结构蛋白自行组装而成的空心结构蛋白颗粒，不含有病毒的核酸，具有良好的安全性，这也是病毒样颗粒疫苗相较于弱毒疫苗的优势。NDVVLPs因其适宜的大小可从外周血被引流到次级淋巴器官中，同时NDV VLPs抗原表面的重复结构使其能被APCs有效摄取，进而诱导机体产生较高水平的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫，是理想的疫苗候选株。

发明内容

本发明目的在于建立一种区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法及试剂盒，从而快速检测并移除新城疫野毒感染禽群，为新城疫的净化提供理论依据。

本发明为解决技术问题所采用的技术方案如下：

本发明的区分新城疫病毒样颗粒疫苗免疫血清与野毒感染血清的间接竞争ELISA方法，包括以下步骤：

步骤一、制备免疫抗原

(1)将NP蛋白基因克隆至T载体中，构建重组克隆质粒T+NP，并测序鉴定；

(2)对重组克隆质粒T+NP和pET28a(+)载体进行双酶切，将回收的目的基因及载体基因进行连接构建重组表达质粒pET28a+NP；

(3)对重组表达质粒pET28a+NP进行诱导表达，经纯化后获得NP蛋白，作为免疫抗原；

步骤二、制备单克隆抗体

(1)将纯化的NP蛋白免疫BALB/c小鼠，再将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0细胞进行融合筛选，制备杂交瘤细胞株；