[发明专利]条件性敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法

说明书

本发明涉及条件性敲除lncRNA DLX6‑os1转基因小鼠的培育方法，有效解决作为动物模型，适用于不同组织器官中研究该lncRNA的作用问题，构建Dlx6‑os1条件敲除载体，Dlx6‑os1基因，转录物：Dlx6‑os1‑201 ENSMUST00000159568.5，位于小鼠6号染色体上的三个外显子，以三个外显子作为条件敲除区域；将C57BL/6小鼠基因文库中RP24‑276P7 and RP24‑260F14的BAC克隆作为模板，进行PCR；在目的载体中，Neo位点旁插入自删除锚定位点，基因敲除区域旁插入loxP位点，DTA阴性选择；与Cre酶介导的基因重组，得基因敲除质粒载体；将基因敲除质粒载体导入ES细胞中，与多种不同器官带有Cre酶的转基因小鼠杂交，得到在不同器官中降低DLX6‑os1表达水平的阳性小鼠。本发明适用于在不同组织器官中研究该lncRNA的作用，开拓了对糖尿病诊断治疗的新途径。

技术领域

本发明涉及医学生物，特别是一种条件性敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法。

背景技术

近年来研究表明，长链非编码RNA（Long non-coding RNA，LncRNA）与糖尿病肾病具有密切的关系，但相关研究报道很少，也没有关于糖尿病肾病患者LncRNA表达谱的报道，不能阐明LncRNA参与糖尿病肾病的发病机制，更无法了解其在糖尿病肾病发生发展中的重要地位。

利用肾脏病特色生物样本库，通过高通量芯片Arraystar人类LncRNA芯片V3.0分别对糖尿病肾病患者（经肾穿刺活检确定）血、尿、肾组织标本进行筛选，并与正常对照组进行比较，初步得到差异表达的LncRNA谱。在LncRNA芯片筛选的结果中，实验发现 LncRNADLX6-AS1（DLX6 antisense RNA 1：RefSeq Gene ID 285987，对应于小鼠的是Dlx6-os1）在糖尿病肾病患者体内的表达水平较正常对照组明显增多，并且与糖尿病肾病患者尿蛋白水平成正相关。进一步通过糖尿病肾病动物模型dbdb小鼠和stz诱导的糖尿病模型小鼠进行验证，发现 DLX6-os1的表达水平与小鼠的尿蛋白的增加成正相关。说明lncRNA DLX6-os1与糖尿病肾病肾脏损伤密切相关，但具体的机制和作用不明。

进一步实验发现lncRNA DLX6-os1在不同的组织器官中表达水平不同，发挥的作用机制也有所不同。为了进一步明确该lncRNA在不同器官中的重要作用，需要改变实验动物不同组织器官的DLX6-os1的表达水平。目前国际普遍应用的方法是注射携带lncRNA的病毒到相应的组织器官，试图改变该lncRNA的表达水平，但存在较多问题：1.病毒的感染效率低，不能实现在特定器官中有效改变lncRNA的表达水平的效果。2.有些lncRNA序列较长，不适合包装病毒或造成病毒的滴度低。3.有些器官不适合进行病毒的感染和注射。

因此，通过基因工程技术对C57小鼠进行基因改造，培育出FLOX-DLX6-os1转基因小鼠，此小鼠可与多种不同器官带有cre酶的转基因小鼠杂交，得到在不同器官中降低DLX6-os1表达水平的小鼠，这些小鼠可应用于不同的疾病模型中，为明确lncRNA DLX6-os1在不同组织器官中的作用提供了非常好的动物模型，有效解决适用于不同组织器官中研究该lncRNA的作用问题，但至今未见有公开报道。

发明内容

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种条件性敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法，可有效解决作为动物模型，适用于不同组织器官中研究该lncRNA的作用问题。

本发明解决的技术方案是，一种条件性敲除lncRNA DLX6-os1转基因小鼠的培育方法，通过基因工程技术对C57小鼠进行基因改造，构建出FLOX-DLX6-os1转基因小鼠，此小鼠可与多种不同器官带有cre酶的转基因小鼠杂交，得到在不同器官中降低DLX-os1表达水平的小鼠，具体是：

1、构建载体