[发明专利]一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法

权利要求书

1.一种生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

S1：生物饲料中基因组DNA的提取：提取生物饲料中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的基因组DNA；

S2：特异性引物的设计：设计植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌的特异性引物；

S3：以步骤S1提取的DNA为模板，用步骤S2中设计的特异性引物作为扩增引物进行荧光定量PCR反应，反应结束后，计算所测样品中五种乳酸菌的数量；

其中S2中设计的特异性引物为：

植物乳杆菌：上游引物CAGCACTAGATACCGCCCTG，下游引物ATGTAGTGCCACGGTCGTTT，扩增长度211bp；

嗜酸乳杆菌：上游引物AGACACGGCCCAAACTCC，下游引物GACAACGCTTGCCACCTA，扩增长度231bp；

长双歧杆菌：上游引物GATTCTGGCTCAGGATGAACGC，下游引物CTGATAGGACGCGACCCCAT，扩增长度231bp；

干酪乳杆菌：上游引物CTATAAGTAAGCTTTGATCCGGAGATT T，下游引物CTTCCTGCGGGTACTGAGATGT，扩增长度：133bp；

鼠李糖乳杆菌：上游引物TGCTTGCATCTTGATTTAATTTTG，下游引物GTCCATTGTGGAAGATTCCC，扩增长度317bp。

2. 如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增体系为20μL，包含SYBR^(R)Green Realtime PCR Master10μL，ROX 0.4μL，上游引物0.8μL，下游引物0.8μL，DNA模板2μL，去离子水补足至20μL。

3.如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，荧光定量PCR扩增的程序为：先经过95℃预变性30s，之后95℃5s，60℃31s，共40个循环。

4. 如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，所述生物饲料中五种乳酸菌基因组DNA的提取方法为：称取1g生物饲料加入9mL的无菌水，摇床振荡10min，使微生物细胞分散，然后静置2-3min；取1mL上清液，10000×g离心2min并重复一次，取1g沉淀放入研钵中，加入液氮充分研磨，加入1mL pH值7.4的0.1mol/L PBS和20μL 20% PVPP，充分均质化后200×g离心5-8min，取上清；沉淀中再加入1mL上述PBS，离心，取上清；合并两次上清，300×g离心5-8min，取上清；再将上清以10000×g离心5-10min，收集菌体，并用PBS洗涤，在得到的菌体中加入300μL裂解液A，其中裂解液A为150mM NaCl，100mM乙二胺四乙酸二钠，pH 8.0、100μL 10%溶菌酶和20μL 1% RNase A,混匀后37℃保温30min，再加入300μL裂解液B及50μL 20% SDS和50μL 20% PVPP，其中裂解液B为100mMNaCl，500mM Tris-HCl, pH 8.0，混匀后冰浴5min，加入等体积的2：24:1体积比的Tris饱和酚：氯仿：异戊醇,10000×g离心10min，取上清，重复离心取上清；加入上清1/10体积的3M醋酸钠及2倍体积乙醇，-20℃沉淀1.5-2h，10000×g离心15-20min，75%乙醇洗涤一次，超净工作台下干燥沉淀，沉淀用50-100μL TE溶解，其中TE为100mM Tris-HCl,1mM EDTA,pH8.0，提取的DNA可立即使用也可-20℃冷冻保存备用。

5.如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，所述生物饲料其含水量为30%-55%，发酵温度为28-37℃，发酵时间为0-30d。

6.如权利要求1所述的生物饲料发酵过程中乳酸菌菌群变化的检测方法，其特征在于，所述生物饲料中植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、长双歧杆菌、干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌在发酵前的添加量为0.1%-10%。