[发明专利]一种LFF2细胞的构建方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种LFF2细胞的构建方法。该方法将细胞用表达抗原表位肽的慢病毒转染抗原呈递细胞后刺激PBMC，之后采用抑制性信号分子的单抗药封闭处理，从而有效的提高T细胞抗肿瘤的能力。

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种LFF2细胞的构建方法。

背景技术：

慢病毒(Lentivirus，LV)为一类逆转录病毒的亚群。由HIV-1改建而来的慢病毒载体系统以其高效而稳定的基因转移效率而成为近年来研究者们的主要选择。由于LV既能感染处于分裂期的细胞，又能感染处于非分裂期的细胞，而且由LV携带整合入宿主基因组的目的基因对转录沉默作用有较强的抵抗力，使得目的基因可在宿主细胞内的长期而稳定表达。同时，慢病毒感染目的细胞的过程与天然HIV病毒感染细胞的过程比较相似，但慢病毒无法自我复制，具有较高的生物安全性。综上所述，与其他逆转录病毒载体相比，LV具有较高的基因转导效率，蛋白表达具有长期稳定性及较高的生物安全性。因此，以慢病毒载体为表达载体，包装为重组慢病毒后感染目的细胞促使其大量表达抗原的方法具有重大优势与意义。

目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL、等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。

现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。还有实验室利用TCR-T技术，靶向递呈MAGE A3抗原。

以上治疗方法并不成熟，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递呈和共培育，但靶点单一(MAGE-3)，仅对非小细胞肺癌等个别癌种起效。虽然也有尝试慢病毒为载体的方法进行转染递呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而简单混合多肽的直接刺激，虽然简单方便，但效率较低。特异性精准多肽的二次刺激不如T细胞受体转导的肿瘤特异性抗原更直接。现有的TCR-T在治疗血液肿瘤和实体肿瘤的解决方案中，缺乏覆盖更多瘤种的精准的TCR。

上述方案均没有考虑T细胞的自我防护技术，使得数量不多的特异性T细胞直接面对强大的肿瘤微环境。

发明内容：

为了解决上述技术问题，本发明将提供一种LFF2细胞的构建方法，该方法将细胞用表达抗原表位肽的慢病毒转染抗原呈递细胞后刺激PBMC，之后采用抑制性信号分子靶点敲除进行保护，从而有效的提高T细胞抗肿瘤的能力。

所述LFF2细胞的制备方法，包括以下主要步骤：1)抽取患者外周血，进行ctDNA外显子测序，或者以肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点，进行抗原表位预测；2)将抗原表位进行多肽连接后，筛选强免疫原性的多肽进行基因合成；3)构建表达抗原表位肽的慢病毒表达质粒，并进行慢病毒包装；4)使用表达抗原表位肽的慢病毒转染抗原呈递细胞，并与PBMC共孵育得到效应细胞；5)将T细胞采用免疫抑制性信号分子的单抗药进行封闭处理，制备得到LFF2细胞。

LFF2细胞具体制备步骤如下：

1、全外显子测序

使用人源外周血进行ctDNA测序或者以肿瘤组织进行全外显子测序和MHC类型检测，将测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；