[发明专利]一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌、构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种高产L‑半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L‑半胱氨酸中的应用。本发明构建了高产L‑半胱氨酸的基因工程菌，经过改造后的大肠杆菌相比于野生型能够更好的利用葡萄糖等碳源物质进行L‑半胱氨酸生产，并且其产量从无提高到3.0±0.1g/L。本发明进一步改造的L‑半胱氨酸转运系统可以减轻产物L‑半胱氨酸对cysE的反馈抑制作用以及其毒害性，达到高产L‑半胱氨酸。

(一)技术领域

本发明涉及一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。

(二)背景技术

半胱氨酸是一种具有重要生理功能的含硫氨基酸，在医药，食品，动物饲料和化妆品行业中的应用范围广泛。其制备方法主要有毛发水解后还原法、酶法合成法、化学合成法和发酵法，然而微生物发酵法因其具有生产成本低、高特异性和对环境污染小等优点，具有广阔的工业应用前景。在大肠杆菌中L-半胱氨酸的生物合成是由cysM或cysK编码的半胱氨酸合成酶专一性催化合成，其中包括硫同化途径和O-乙酰丝氨酸的供给过程。在O-乙酰丝氨酸过程中，其中serA基因受L-丝氨酸的反馈抑制以及cysE基因受L-半胱氨酸的反馈抑制，而L-丝氨酸和O-乙酰丝氨酸都是合成L-半胱氨酸前体物质，因此得到可以抗反馈抑制的突变基因对于提高L-半胱丝氨酸的生产能力具有重要意义。在已报道的文献中已经有对serA和cysE基因进行抗反馈抑制的研究，对L-半胱氨酸产量的提升起到了一定效果。

氨基酸根据其化学结构的相似性及合成前体物的不同，其中丝氨酸-甘氨酸-半胱氨酸族的合成前体物均为糖酵解过程中产生的3-磷酸甘油酸。微生物体内由serA、serB和serC基因编码的丝氨酸合成酶可以使3-磷酸甘油酸合成丝氨酸以及sdaA、sdaB和tdcG基因编码的丝氨酸脱氨酶可以将L-丝氨酸降解成丙酮酸和氨气，为了使L-丝氨酸能大量积累，需要增强serA、serB和serC基因以及敲除sdaA、sdaB和tdcG基因。

硫和O-乙酰丝氨酸是E coli合成L-半胱氨酸的直接前体物质。而L-丝氨酸是O-乙酰丝氨酸的唯一前体物质，为了使大量丝氨酸转化成O-乙酰丝氨酸，必须增强具有反馈抑制的cysE基因。同时加强硫同化途径，其中正调控转录因子cysB对cysU,cysP,cysW,cysA,cysM,cysK等基因转录水平有促进作用，需要cysB基因增强表达。从而为了防止胞内积累的L-半胱氨酸降解，需要敲除其降解基因Tnaa和Yham.相关文献报道L-半胱氨酸少量胞内积累对细胞有毒害作用，为了降低胞内L-半胱氨酸的含量从而减轻对细胞毒害作用和cysE基因的反馈抑制作用，过表达eama基因以实现增强L-半胱氨酸外运系统。

(三)发明内容

本发明的目的在于代谢工程和基因编辑技术，提供高产L-半胱氨酸的基因工程菌及其构建方法，以及该基因工程菌在微生物发酵制备L-半胱氨酸中的应用。

一种高产L-半胱氨酸的基因工程菌，由如下方法构建而成：

(1)将底盘菌E.coli W3110基因组中的serA基因、serB基因和serC基因的启动子更换为trc启动子，得到E.coli W3110 serA serB serC(trc)；

(2)应用CRISPR-Cas9基因编辑将E.coli W3110 serA serB serC(trc)中serA基因编码的氨基酸进行H344A/N346A/N364A点突变，得到对胞内丝氨酸浓度耐受性增强的E.coli W3110 serA^fbr serB serC；

(3)将E.coli serA serB serC(trc)基因组中的sdaA基因、sdaB基因和tdcG基因敲除，得到E.coli W3110 serA serB serC(trc)ΔsdaA ΔsdaB ΔtdcG；