[发明专利]一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法

权利要求书

1.一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：包括用于获取缺失型人角质细胞生长因子-1的重组表达方法、重组缺失型人角质细胞生长因子-1的捕获、用于形成重组缺失型人角质细胞生长因子-1的102位和106位间的一对二硫键的二硫键形成方法、重组缺失型人角质细胞生长因子-1的精纯化，其中，缺失型人角质细胞生长因子-1的氨基酸序列特征为SEQ ID NO:1；

重组缺失型人角质细胞生长因子-1的捕获：从-20℃冰箱中取出菌体，放入缓冲液50mmol/L Na₂CO₃，pH9.0中重悬，室温搅拌过夜；取出上述溶液并在300bar下高压破碎；然后在10000rpm下离心10min，收集破菌上清液；取破菌上清，经阳离子柱层析SP Sepharose FF捕获回收△N23KGF-1；采用2柱体积以上平衡液50mmol/L Na₂HPO₄，pH8.0平衡SP柱，上样；上样结束后，采用2柱体积以上平衡液50mmol/L Na₂HPO₄ pH8.0复平衡，含50mmol/L Na₂HPO₄、0.35mol/L NaCl，pH8.0的洗脱液1洗脱去除部分杂蛋白，含50mmol/L Na₂HPO₄、0.5mol/L的NaCl，pH8.0的洗脱液2洗脱收集目的蛋白△N23KGF-1；

重组缺失型人角质细胞生长因子-1的二硫键配对形成：取捕获回收的△N23KGF-1，稀释至蛋白浓度0.2mg/mL-1.0mg/mL，调节pH至8.0-8.5，补入半胱氨酸终浓度10mmol/L，30℃缓慢搅拌反应10h，在10000rpm下离心10min，收集上清液；

重组缺失型人角质细胞生长因子-1的精纯化：将复性后的△N23KGF-1溶液，用Source30S柱层析进行纯化；用平衡液10mmol/L His，pH6.5平衡后，上样分离纯化目的蛋白，用含10mmol/L His的0-1000mmol/L的NaCl，pH6.5线性梯度洗脱，收集含目的蛋白的洗脱峰；

重组表达中的宿主菌为大肠杆菌。

2.根据权利要求1所述的一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：所述重组表达方法包括以下步骤：

A1人工全基因合成缺失型人角质细胞生长因子-1的核苷酸序列，然后将其进行NdeⅠ/BamHⅠ双酶切或NcoⅠ/HindⅢ双酶切，并连接至含T7启动子或BAD启动子的表达载体中，构建得重组质粒；

A2将A1步骤所得的重组质粒转入表达宿主，筛选高拷贝转化子；

A3将A2步骤所得的转化子转入培养基中发酵培养，用诱导剂诱导表达得到可溶性缺失型人角质细胞生长因子-1。

3.根据权利要求2所述的一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：所述A2步骤中，所述表达宿主为适宜T7启动子或BAD启动子调控的表达载体的大肠杆菌。

4.根据权利要求2所述的一种缺失型人角质细胞生长因子-1的重组制备方法，其特征在于：所述A3步骤中，所述诱导剂为乳糖或半乳糖或IPTG或阿拉伯糖，培养温度和诱导温度为15℃-37℃，诱导时间为2h-24h。