[发明专利]一种快速鉴定芽叶早生茶树种质的分子标记方法

权利要求书

1.一种利用dCAPS标记引物鉴定芽叶早生茶树种质的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

（1）茶树种质叶片基因组DNA提取；

（2）PCR扩增；

（3）利用限制性内切酶EcoRⅠ酶切PCR扩增产物；

（4）电泳检测酶切产物并获得电泳图谱；

（5）分析待测种质电泳图谱；

步骤（5）所述分析待测种质电泳图谱方法为：将待测茶树种质资源电泳图谱与早生茶树种质资源标准电泳图谱比较，如果图谱一致，则判定该待测茶树种质为芽叶早生茶树种质；

所述dCAPS标记引物序列如下：

上游引物序列： 5’-ACCAGGCCAAGATCAAGACAAGAAT-3’；

下游引物序列： 5’-TCGGAACAATAGCACTACTAACGGT-3’。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）所述茶树种质叶片基因组DNA提取的具体操作为：

1）将研钵中加入3mL 1.5%CTAB溶液，取2.0g样品放到研钵中研磨均匀，吸取1.0mL研磨溶液转入2.0mL离心管中，置65℃水浴1h，间隔15min轻轻混匀1次；

2）冷却后，加入600uL的氯仿/异戊醇溶液，混匀，12000r/min，离心15min；

3）吸上清，转入新的1.5mL离心管，重复2）步骤1次；

4）吸上清，转入新的离心管中，加入1/3体积的3mol/L 的NaAc和1mL-20℃预冷的无水乙醇，混匀后置于-20℃静置30min；

5）12000 r/min，10min，弃上清；

6）加入75%v/v的乙醇溶液洗涤2次，置于吸水纸上倒置晾干；

7）加入50uL ddH₂O溶解，即为基因组DNA。

3.根据权利要求 2所述的方法，其特征在于，步骤1）所述1.5%CTAB溶液中，含有终浓度1.5wt% CTAB，0.1M Tris，20 mmol/L EDTA，1.4M NaCl，所述1.5%CTAB溶液的pH为8.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR扩增的反应体系为：ddH₂O16μL，10×Buffer 3 μL，10 mmol/ L dNTP 3 μL，Mgcl₂ 2μL，10 μmol/ L上、下游引物各1.5μL，0.5 U Taq酶1 μL，模板基因组DNA 2 μL。

5.根据根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）所述PCR热循环程序为：94 ℃预变性5 min，使模板DNA充分变性，然后进入下列温度循环：94 ℃变性1 min，60℃退火0.5min，72 ℃延伸0.5 min，重复35个热循环；72 ℃延伸5 min，最后4℃保存。

6.根据根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）所述酶切反应体系为：EcoRⅠ限制性内切酶1μL，10×H Buffer 5μL，DNA 1μg，灭菌水补齐至50μL；37℃酶切1h。