[发明专利]一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法

说明书

本发明涉及BPDE加合靶蛋白的鉴定领域，具体是一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法。该方法包括1）收集细胞及提取蛋白；2）细胞裂解物的染毒及蛋白酶消化；3）质谱前样品准备；4）LC‑MS/MS分析：取肽段进行色谱分离；肽段分离后用质谱仪进行DDA质谱分析；5）质谱数据库检索：下载蛋白质数据库，根据质谱分析数据获得BPDE靶蛋白。该方法可直接鉴定蛋白裂解物中可与BPDE加合的靶蛋白，并且在检测过程中不需要对小分子进行化学修饰、不会影响到小分子原有的活性、不受任何细胞和组织类型限制、不要求使用纯蛋白质，甚至可以使用全细胞裂解物，可广泛应用于小分子加合靶蛋白的鉴定。

技术领域

本发明涉及BPDE加合靶蛋白的鉴定领域，具体是一种BPDE加合靶蛋白的鉴定方法。

背景技术

苯并[a]芘(Benzo[a]pyrene，B[a]P)是最常见的环境和职业污染物。近年来研究表明神经系统异常如认知功能障碍，学习困难，副交感神经失调和短期记忆丧失均与B[a]P暴露有关。B[a]P暴露后的大鼠在Morris水迷宫测试时表现出短期学习和空间记忆能力受损以及长时程增强(Long-term potentiation,LTP)减弱；人群流行病学调查结果显示，B[a]P职业暴露的焦炉工人表现出学习记忆能力降低，与B[a]P接触水平之间存在剂量-反应关系。但B[a]P神经毒性分子机制仍然不清楚。B[a]P在体内转化成高诱变性的活性代谢物7,8-二氢二醇-9,10-环氧苯并芘(BPDE)被认为是在细胞内的终毒物，其除了可与DNA形成加合物外，也能够与蛋白形成加合物。小分子物质与细胞内靶标的相互作用，是其发挥作用的基础。由于蛋白质在神经信息处理过程中扮演重要的角色，因此明确BPDE的加合靶蛋白，有助于深入研究B[a]P神经毒性损伤的作用机制，而直接识别小分子化合物的有益或有害作用的靶蛋白一直都是研究的重点和难点，以往报道的B[a]P或代谢物BPDE在蛋白质组水平上的作用则主要是通过蛋白质表达差异做出的推测。传统的鉴定小分子加合靶蛋白的方法，需对小分子化合物进行化学修饰，如添加琼脂糖小球、生物素标签或进行荧光标记、光亲和标签等，并需要进行大量的结构-活性关系(SAR)研究以确保添加的小分子标签不会损害到药物原本的生物活性。然而在小分子化学修饰的过程中，不可避免地会影响到其原有的活性或阻碍其与真正靶蛋白的结合，影响靶标鉴定的真实性。因为需要合适的标签，可鉴定的小分子药物也受到很大限制。

现有技术的主要缺点：

1.对于BPDE的加合靶蛋白，以往常通过含量或者功能改变来进行推测，并无直接证据。

2.其他小分子化合物加合靶蛋白的鉴定方法，需对小分子化合物进行化学修饰，如添加生物素或荧光素等生物标签，修饰过程可能会改变小分子的活性。

3.不需要对小分子化合物进行修饰的加合靶蛋白鉴定方法，如基于小分子亲和性的蛋白稳定性的靶蛋白鉴定方法要么可鉴定的分子靶标数量有限，要么实验条件、操作技术方面要求很高，很难达到条件，要么只能鉴定某种特定的蛋白。

研究者又基于药物亲和响应目标稳定性(drug affinity responsive targetstability，DARTS)的原理开发出不需要对小分子药物进行修饰的靶标筛选新方法。即当靶蛋白与小分子药物加合后会表现出稳定性的改变，从而对蛋白酶水解的敏感性改变。与传统方法相比，基于这种原理建立的加合靶蛋白筛选技术，不需要对小分子进行任何修饰标记，保存了与靶蛋白结合的原始特性又独立于药物的任何生物效应，避免了对小分子药物进行化学修饰从而对原有活性产生的任何影响，因此特别适用于像BPDE这种结构复杂、无法进行化学修饰的药物的靶标识别，但是在方法中，需要将蛋白酶消化后的蛋白通过SDS-PAGE电泳分离后，切取差异条带，对差异条带胶内酶解进行鉴定，只能鉴定到少数个别的加合靶蛋白，使得鉴定到的蛋白信息大打折扣。因此，就鉴定BPDE加合靶蛋白的目的而言，目前尙缺少一种既不需要对小分子进行化学修饰，又可大批量鉴定BPDE加合靶蛋白的方法。

发明内容