[发明专利]一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用

说明书

本发明涉及一种褐藻胶裂解酶突变体及应用，属于酶工程和基因工程领域，该突变体在序列SEQ ID NO.3基础上将第226位E突变为K，经过表达，突变体酶活提高1.11倍，粗酶液经过纯化后比活力较截短酶AlgL‑T157N提高1.03倍；突变体最适温度55℃，在pH 6.0‑8.0内保温1 h酶活力基本不变，具有较强pH稳定性；突变体对褐藻酸钠、Poly M和Poly G的催化效率K_cat/K_m分别比AlgL‑T157N提高10.22、8.59、2.97倍。本发明采用结构序列分析和软件辅助筛选相结合的方法，确定突变位点，通过PCR定点突变得到催化活性提高的突变体，为其进一步的工业化应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，属于酶工程和基因工程领域。

背景技术

褐藻胶裂解酶是一种降解褐藻中海藻酸盐的裂解酶，主要通过4-O-糖苷键的β-消除反应催化藻酸盐的解聚，并在非还原端C-4和C-5之间产生具有不饱和双键的寡聚糖醛酸结构。根据褐藻胶裂解酶的底物偏好性可分为poly M，poly G和poly MG特异性裂解酶；根据作用方式的不同，又可分为内切酶和外切酶，内切酶主要切割海藻酸聚合物内部的糖苷键，产生不饱和低聚糖，而外切酶则是进一步将褐藻寡糖降解为单糖。

目前随着对褐藻寡糖研究的深入，越来越多的生物活性被发现，如抗肿瘤、抗过敏、抗菌、凝血、抗逆和抗氧化等，其广泛的应用价值促进了研究人员对褐藻寡糖制备方法的进一步探索。传统的褐藻寡糖降解法主要有：酸解、碱解、氧化降解，这些降解方法不仅容易造成环境污染，而且所得到的寡糖生物活性低且效果差。相反，酶法制备褐藻寡糖不仅条件温和，得率高、易受控制、不污染环境，还具有较好的寡糖生物活性，因此逐渐取代传统化学降解法成为主要的寡糖制备方式。然而当前筛选到的多是底物特异性差、酶活性低的褐藻胶裂解酶，应用于工业化的褐藻胶裂解酶产品少之又少，所以获得具有高活性和广泛底物特异性的褐藻胶裂解酶成了当前的研究重点，尤其是通过基因工程及蛋白质工程手段提高褐藻胶裂解酶的催化活性，更是受到了大多数研究者的青睐。

本发明采用结构序列分析和Discovery Studio软件辅助筛选相结合的方法，确定突变位点，并通过PCR定点突变得到催化活性明显提高的突变体，为其进一步的工业化应用奠定基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种褐藻胶裂解酶突变体及其应用，采用结构序列分析和Discovery Studio软件辅助筛选相结合的方法，确定突变位点，并通过PCR定点突变得到催化活性明显提高的突变体，为其进一步的工业化应用奠定基础。

为实现上述目的采用以下技术方案：

本发明中的褐藻胶裂解酶基因AlgL（核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示）来源于分离自舟山群岛海水的Pseudoalteromonas sp. zb7-4，全长1203 bp，编码400个氨基酸，第1-31位氨基酸为信号肽，32-131位氨基酸为碳水化合物结合结构域（即CBM结构域），197-385位氨基酸为催化结构域。在157-158位氨基酸之间进行截断，截除第1-157位氨基酸，得到褐藻胶裂解酶截短酶AlgL-T157N，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。