[发明专利]一种胶原蛋白变性温度的测定方法

说明书

本发明公开了一种胶原蛋白变性温度的测定方法，在胶原蛋白样品中加入醋酸溶液于低温下溶解，使用天狼星红对不同变性程度的胶原蛋白样品进行染色，将生成的沉淀溶于碱液后于550nm处测量吸光值并绘制拟合曲线，通过拟合方程计算即可得出胶原蛋白变性温度；通过本方法来判断胶原蛋白的变性温度，结果重现性好，特异性强，操作简单，可用于胶原蛋白产品品质的检测。与其他检测技术相比，该方法具备操作简单、设备需求小的特点，非常适合作为胶原蛋白变性温度的常规检测手段。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种胶原蛋白变性温度的测定方法。

背景技术

胶原蛋白是由三条肽链形成的右手超螺旋纤维状蛋白质，是动物结缔组织中重要的蛋白质。结缔组织因为有较高含量的胶原蛋白，所以具有一定的结构与机械力学性质，如张力强度、拉力、弹力等以达到支撑和保护机体的作用。由于胶原蛋白有诸多优良性质，使得这类生物高分子化合物的用途非常广泛，遍及医药、化工、食品等领域，其中生物材料与医药方面的应用是目前研究的主要课题。

胶原蛋白的热稳定性随胶原蛋白来源的不同有差异，尤其是目前研究广泛的水产Ⅰ型胶原，其最显著特点就是热稳定性比较低，呈现出鱼种的特异性。其热稳定性与水产动物的生存环境和体温有关，另外还与其亚氨基酸(脯氨酸和羟脯氨酸)的含量有关，尤其是羟脯氨酸含量。因此在提取水产胶原蛋白时更需明确原料中胶原的变性温度并控制提取温度。而目前对胶原蛋白变性温度的测定方法有圆二色谱法、紫外光谱法、傅立叶变换红外光谱法、超灵敏差示扫描量热法、粘度法等，但该类方法操作繁琐且仪器设备需求高，因此对于胶原蛋白变性温度测定同样需要一种简便快捷的测定方法。

发明内容

本发明的目的是要建立一种胶原蛋白变性温度的测定方法，该方法可用于胶原蛋白变性温度的测定，具有操作简单，结果重现性好，特异性强等优点。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种胶原蛋白变性温度的测定方法，在胶原蛋白样品中加入醋酸溶液于低温下溶解，使用天狼星红对不同变性程度的胶原蛋白样品进行染色，将生成的沉淀溶于碱液后于550nm处测量吸光值并绘制拟合曲线，通过拟合方程计算即可得出胶原蛋白变性温度；

本发明利用胶原蛋白热变性程度与天狼星红染色测得吸光值（OD）存在一定线性关系的特点，使用天狼星红对不同变性程度的胶原蛋白样品进行染色，将生成的沉淀溶于等量碱液后于550nm处测量吸光值并绘制拟合曲线，通过拟合方程计算即可得出较为准确地胶原蛋白变性温度。其中将吸光值未下降部分称为天然态，该部分吸光值取均值记为OD₀。将吸光值下降部分称为过渡态，将该部分数据点进行线性拟合得到拟合方程OD=a×T+c。将胶原蛋白变性温度定义为当吸光值为胶原蛋白天然态吸光值平均数的90%时所对应的温度，即可计算得到胶原蛋白样品的变性温度，具体计算方法如下：

Td=（90%×OD₀-c）÷a。

一种胶原蛋白变性温度的测定方法具体方法如下：

（1）制备储备液：取待测胶原蛋白原料样品，加入预冷的0.1-1M醋酸溶液于0-10℃下溶解，并装于A瓶中；

（2）分装样品：从A瓶中取等量溶解后样品置于离心管B、C1、C2、C3、C4、……Cn中；

（3）变性处理：B管始终处于0-10℃，该低温状态使得胶原蛋白三螺旋结构不被热力破坏； C1、C2、C3、C4、……Cn管分别放入高温水浴处理2-30min后取出，并迅速置于冰水浴中；

（4）染色：步骤（3）中得到的B、C1、C2、C3、C4、……Cn离心管中加入17-600μg/mL的天狼星红染液0.1-5mL，染色1-60min；

（5）离心：等待染色完成后，3000-21000r/min离心1-60min，弃去上清液，得到天狼星红-胶原蛋白复合沉淀；