[发明专利]一种纯化Fc融合蛋白的纯化方法

说明书

本发明公开了一种纯化Fc融合蛋白的纯化方法，其技术方案要点是其步骤为：(1)用Mabselect SuRe LX捕获GLP‑1‑Fc融合蛋白；(2)用Capto Q ImpRes离子交换层析进一步去除降解片段；(3)用CHT I型填料去除大量的聚集体。本发明能够去除目的蛋白中的降解和聚集体。

技术领域

本发明涉及一种Fc融合蛋白，更具体的说，它涉及一种纯化Fc融合蛋白的纯化方法。

背景技术

Fc融合蛋白是指利用基因工程等技术将某种具有生物学活性的功能蛋白分子与IgG的Fc片段融合产生的新型蛋白。功能性蛋白分子连接Fc片段后，提高了功能蛋白的稳定性，并增加了体内的半衰期。Fc片段可以融合一种或两种不同的功能片段，形成高效的靶向药物，该类蛋白不仅保留了功能蛋白的生物学活性，并且保留了Fc段介导的ADCC和CDC效应的能力。2018年上半年全球药物销售额Top 15中，Fc融合蛋白类药物(Amgen/Pfizer的Enbrel和Bayer/Regeneron的Eylea)销售占两席，其中Enbrel的2018年上半年销售额达34.64亿美元。

Fc融合蛋白在动物细胞表达上清中稳定性较差，容易形成降解和多聚。常规的纯化方法包括亲和层析快速捕获，阴阳离子交换层析或疏水层析精纯进一步去除产品相关杂质，如降解和多聚，以及除去工艺相关杂质，如HCP、HCD及protein A脱落等。聚集体的去除主要应用阳离子层析和疏水层析。研究发现聚集体的含量≥10％后，阳离子层析和疏水层析就很难达到理想的效果，而Bio-Rad公司的羟基磷灰石填料可以去除大量的聚集体。羟基磷灰石(CHT)，分子式：Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂，是一种磷酸钙化合物，包括钙离子(C位点)，羟基，磷酸根(P位点)。CHT具有独特的分离效果，良好的选择性和分辨率，经常用于分离其它介质所不能分离的、性质比较接近的蛋白。Bio-Rad公司的CHT分两种类型，CHT I型和CHT II型，其中CHT I型的蛋白载量比较高，且对酸性蛋白具有更高的载量。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种去除目的蛋白中的降解和聚集体的纯化Fc融合蛋白的纯化方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种纯化Fc融合蛋白的纯化方法，其步骤为：

(1)用Mabselect SuRe LX捕获6LP-1-Fc融合蛋白；

(2)用Capto Q ImpRes离子交换层析进一步去除降解片段；

(3)用CHT I型填料去除大量的聚集体。

本发明进一步设置为：根据步骤(1)，其具体操作步骤为：

(1.1)用亲和平衡液平衡层析柱4个柱体积；

(1.2)上样，上样保留时间为4-10min；

(1.3)完成上样后，用亲和平衡液再平衡3个柱体积，然后用淋洗液冲洗4个柱体积；

(1.4)再用醋酸盐冲洗层析柱3个柱体积，样品用醋酸盐洗脱，收集主峰；

(1.5)用NaOH清洗3个柱体积，用平衡液平衡至pH稳定后，2个柱体积的乙醇保存层析柱。

本发明进一步设置为：步骤(1.1)中，亲和平衡液为25mM Tris，25mM NaCl，pH7.5；

步骤(1.3)中，淋洗液为25mM Tris，0.3M NaCl，pH7.5；

步骤(1.4)中，冲洗的醋酸盐为50mM醋酸盐-pH4.5，洗脱的醋酸盐为50mM醋酸盐-pH＝3.5；

步骤(1.5)中，NaOH为0.1M NaOH，乙醇为20％乙醇。