[发明专利]一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒

说明书

本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒及其使用方法，本发明试剂盒由甲基化敏感性限制性内切酶、一对扩增AR基因第一外显子的一个CAG三碱基STR位点的带有FAM荧光标记的引物、一对扩增MIC2基因的带有FAM荧光标记的引物和DNA聚合酶组成。采用本试剂盒诊断和家系分析，可判断异常X染色体的来源。此外，本试剂盒含有双重PCR引物进行扩增，扩增条件稳定、特异、灵敏。

技术领域

本发明属于生物技术及核酸检测技术领域，尤其涉及一种用于检测X染色体失活的双重PCR分子诊断试剂盒及其使用方法，此外，本发明还涉及上述检测试剂盒在生物医学中的应用。

背景技术

1、X染色体失活简介

X染色体失活或里昂化(lyonization)是指雌性哺乳类细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象，在此过程中X染色体会被包装成异染色质，进而因功能受抑制而沉默化。女性体细胞组织是由两类细胞构成的嵌合体，部分细胞中父本X染色体有活性(图1中浅色小球代表)，其余细胞中母本X染色体有活性(图1中深色小球代表)。理论上这两部分细胞的比例应为1:1，当这一比率发生显著偏差(图1中B或C)时，称为X染色体失活偏移(showedX-chromosome inactivation，SXCI)。

2、X染色体失活检测的应用领域

针对伴X染色体隐性遗传病(XR)的女性患者来说，遗传检测证实其存在疾病相关基因突变，但突变为杂合子，理论是不发病的，可以推断其携带野生型基因的X染色体发生了失活，适用于该项检测；针对伴X染色体显性遗传病 (XD)的患者家属来说，遗传检测证实其存在基因突变，理论是发病的，但其临床表型正常，可以推断其携带突变型的X染色体发生了失活，同样适用于该项检测。因此X染色体失活多用于X染色体连锁疾病的研究上，X染色体失活的具体类型是该类疾病病因诊断的重要指标：此类疾病常见的有血友病、杜氏进行性肌营养不良、神经性腓骨肌萎缩症、Alport综合征、肾上腺脑白质营养不良、无汗性外胚层发育不良、红绿色盲、眼脑肾综合征、Lesch-Nyhan综合征、睾丸女性化、X连锁隐形遗传(女性遗传性)肾性尿崩症等。

3、X染色体失活的剂量补偿效应

Lyon假说是1961年M.F.Lyin提出的阐明哺乳动物剂量补偿效应的X染色体失活假说，主要内容有：正常雌性哺乳动物体细胞中，两条染色体中只有一条在遗传上是有活性的，其结果是X连锁基因得到了剂量补偿，保证雌性个体具有相同的有效基因产物。失活是随机的，发生在胚胎发育早期，某一细胞的一条染色体一旦失活，这个细胞的所有后代细胞中的该条X染色体均处于失活状态。杂合体雌性在伴性基因的作用上是嵌合体，即某些细胞中来自父方的伴性基因表达，某些细胞中来自母方的伴性基因表达，这两类细胞镶嵌存在。

4、X染色体失活的检测

X染色体失活中心(Xic)的存在对于X染色体失活至关重要：携带Xic的 X染色体可以遭受失活，而缺乏它的则不能。Xic的功能依赖于Xist，一个编码特定功能性非编码RNA的基因，XIST并不足以维持体细胞杂交体中X染色体的失活，同时，XIST也不是X失活的维持所必须的，在X失活的维持中起主要作用的是DNA的甲基化。其检测方法主要有表达方法和甲基化方法两种。表达方法是用RT-PCR的方法仅使表达的XIST基因反转录成cDNA，然后用PCR扩增反转录DNA。表达方法需进行反转录操作，过程繁琐，对技术人员要求较高。甲基化方法主要是利用甲基化敏感性的限制性内切酶对基因组DNA进行消化，失活的X染色体是甲基化的，不会被酶切，而有活性的X染色体是非甲基化的，可以被酶切为碎片。然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳或变性高效液相色谱法对酶切前后的PCR产物进行检测，判断出两条X染色体的失活比例。聚丙烯酰胺凝胶电泳法费时费力，变性高效液相色谱法灵敏度低，特异性不好，二者均不适用于临床推广。

发明内容