[发明专利]一种基于针尖纳米孔单分子检测技术的实时监控酶切反应的方法

说明书

本发明涉及一种基于针尖纳米孔单分子检测技术的实时监控酶切反应的方法，属于荧光检测技术领域，该方法中利用针尖纳米孔将溶液分为纳米孔内和纳米孔外两个区域，在电泳驱动下使剪切酶和/或能够与荧光标记的基因特异性吸附的物质进入针尖纳米孔内，或者使负载有荧光标记的基因的纳米材料进入凹槽内(即针尖纳米孔外)，通过观察电流信号和荧光信号的变化实现实时监控酶切反应。针尖纳米孔对检测区域的物理分离，以及电泳控制待检测分子的移动，避免了其他外界因素对反应的干扰，膜片钳和荧光显微镜技术的结合能实时观察到反应动态，为纳米材料对酶切保护机理的研究提供更直接的证明。

技术领域

本发明属于荧光检测技术领域，具体涉及一种基于针尖纳米孔单分子检测技术的实时监控酶切反应的方法。

背景技术

纳米孔单分子检测技术是近年来广泛应用于DNA，RNA，蛋白质等生物大分子检测领域的新型技术，被认为是最有潜力的单分子检测技术。其中，针尖纳米孔技术是固态纳米孔中的一种，相对于传统的固体薄膜纳米孔，具有成本低廉、易于制造、性能稳定等显著优点。

无机纳米材料非病毒型基因载体因其良好的稳定性和生物相容性，在生物分析领域已引起广泛关注。但是，人们对此类基因载体在基因传递过程中的各种关键因素还缺乏深入的了解，由于外源基因在细胞内的酶切保护问题是影响基因转染成败的重要因素之一，石墨烯、金纳米、二氧化硅纳米颗粒作为新型的非病毒型基因载体，电泳技术和荧光偏振技术研究发现纳米材料与核酸分子的相互作用证明可以抵抗核酸酶的降解，但纳米材料保护基因的研究机理仍然有待探讨，因此需要一种能够实时监控酶切反应的方法，以便于更好的研究纳米材料保护基因的原理。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于针尖纳米孔单分子检测技术的实时监控酶切反应的方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种基于针尖纳米孔单分子检测技术的实时监控酶切反应的方法，所述方法包括如下步骤：

首先向针尖纳米孔101内注入含纳米材料的电解质溶液，备用；所述纳米材料上负载有荧光标记的基因；然后取具有凹槽105的盖玻片102，向所述凹槽内注入含剪切酶和/或能够与所述荧光标记的基因特异性吸附的物质的电解质溶液，将所述针尖纳米孔固定在所述盖玻片上且所述针尖纳米孔的针尖位于凹槽内；接着连接膜片钳106，将所述膜片钳探头端引出的电极104插入所述针尖纳米孔内，另一端电极103置于所述凹槽内；最后将所述盖玻片置于倒置荧光显微镜107上，在所述膜片钳控制电泳驱动下使剪切酶和/或能够与所述荧光标记的基因特异性吸附的物质进入所述针尖纳米孔内，或者使纳米材料进入所述凹槽内，通过观察电流信号和荧光信号的变化实现实时监控酶切反应。

优选的，所述电解质溶液为浓度是200-500mM，pH＝7-8的KCl溶液或NaCl溶液中的一种。

优选的，所述纳米材料具有荧光淬灭效果。

优选的，所述纳米材料为氧化石墨烯、金纳米或二氧化硅中的一种或至少两种形成的复合纳米材料。

优选的，所述凹槽的底部厚度为0.13-0.17mm。

优选的，所述膜片钳探头端引出的电极为Ag/AgCl电极或铂丝电极中的一种，另一端电极为Ag/AgCl电极或铂丝电极中的一种。

优选的，所述针尖纳米孔的针尖直径为5-500nm。

优选的，所述针尖纳米孔的制备方法如下：

将毛细管浸泡于食人鱼刻蚀液中在25-80℃下处理15-120min，然后取出所述毛细管经清洗后烘干，最后利用模板法或拉直法制出针尖纳米孔。

所述毛细管的外部直径为1-2mm，内部直径为0.5-1.16mm。