[发明专利]一种重组脂肪干细胞及其重组方法

说明书

本发明提供了一种重组脂肪干细胞及其重组方法，属于基因工程技术领域，将携带有hFIX基因的腺病毒转染到脂肪干细胞中，得到重组脂肪干细胞。在本发明中，将携带hFIX基因的腺病毒转染脂肪干细胞，转染后得到的重组脂肪干细胞可以表达hFIX蛋白。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种重组脂肪干细胞及其重组方法。

背景技术

血友病B是由于FIX缺乏或功能缺陷导致的出血性疾病，为伴X染色体隐性遗传病。病情严重程度与FIX的缺乏程度相关，根据血友病B患者体内FIX活性水平的不同，可以将患者分为3类：凝血因子FIX活性(coagulation factorIX:Activity，FIX：C)＜1％为重型，1％≤FIX：C≤5％为中间型，5％≤FIX：C≤40％为轻型。该病在男性新生儿中的发病率约为1/25000，据估计我国血友病B患者总数约为20000名，占血友病患者总数的15％-20％。目前临床上对血友病B的治疗主要使用替代疗法，即通过输注重组血源性的 FIX(Factor IX，凝血因子IX)以恢复患者血浆中的凝血因子水平达到治疗效果。替代疗法可以有效地治疗和预防急性出血，但不能预防关节损伤的发生，除非在儿童期即开始预防性治疗，发达国家一般建议重型血友病B患者每周注射2-3次的FIX。我国血友病患者由于治疗费用高昂，绝大多数迫于经济压力未能接受规范性治疗。

血友病B目前尚无治愈的方法，但单基因遗传的生理特性，使其成为基因治疗研究理想的选择。国内外众多实验研究表明基因治疗血友病B能够使凝血因子IX水平提高，这使治愈血友病B成为可能。

血友病B的基因治疗途径可分为体内(invivo)途径和体外(ex vivo) 途径。Invivo途径指直接将携带有目的基因的载体注入患者体内，该方法的优点是操作方便、成本低、治疗时周期短、易于推广，代表基因治疗的发展方向，然而载体和基因导入后易引起患者体内强烈的免疫反应，安全性隐患高，并且有些病毒载体易遭患者体内血清补体灭活而不能达到理想的治疗效果。Ex vivo途径指将患者的体细胞取出后，在体外培养同时导入目的基因，而后将遗传修饰后的细胞再回输给患者。该方法比较经典，安全易控制，基本不会引起患者的免疫排斥且不存在病毒在体内被灭活的问题，但是每次基因治疗都需要基因转移、克隆筛选、安全性检测、操作较为繁琐、治疗周期长、技术复杂、费用较高。

既往体外不同体细胞的FIX基因转导实验成功验证了FIX因子的体外表达。然而，转基因治疗血友病动物的实验结果显示，体内高水平表达的FIX 因子随着时间的延迟都会出现表达量的下降，其原因主要是基因传递系统自身的低效和基因修饰后细胞，表达转基因产物后引起的免疫原反应介导表达量的下降。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组脂肪干细胞及其重组方法。在本发明中，将携带hFIX基因的腺病毒转染脂肪干细胞，转染后得到的重组脂肪干细胞可以表达hFIX蛋白。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种重组脂肪干细胞，将携带有hFIX基因的腺病毒转染到脂肪干细胞中，得到重组脂肪干细胞。

本发明还提供了上述技术方案所述的重组脂肪干细胞的重组方法，包括：

当脂肪干细胞的融合度为80％时，将携带有hFIX基因的腺病毒与脂肪干细胞混合后进行转染，得到重组脂肪干细胞。

优选的，当原代脂肪干细胞传至第3代时，与携带有hFIX基因的腺病毒进行转染。

优选的，所述转染的条件包括：

所述转染的温度为35～40℃，所述转染的时间为24～72h。

优选的，所述转染在5％CO₂下进行。