[发明专利]一种突变型GABRG2转基因斑马鱼癫痫模型的构建方法及应用

权利要求书

1.一种突变型 GABRG2 转基因斑马鱼癫痫模型的构建方法，其特征在于将突变人GABRG2 基因转入斑马鱼使其成为具有癫痫表型的斑马鱼系，所述突变人 GABRG2 基因为人GABRG2 第 343 位氨基酸 Phe 密码子中碱基T 突变为C，基因序列如SEQ ID No：1 所示，采用 gateway 技术构建表达载体，表达载体为 pDestTol2CG2。

2.如权利要求1 所述的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）GABRG2 突变体表达载体的构建：合成突变人 GABRG2 基因，将其克隆至 pME-MCS质粒载体，构建得到middle entry clone: pME-GABRG2^1027TC；克隆含 HuC 神经元特异性启 动子区序列，构建载体 5’entry clone：p5E-HuC 和 3’entry clone：p3E-polyA；通过Gateway LR 反应将 5’entry clone、middle entry clone 和 3’entry clone 载体重组克隆至表达载体 pDestTol2CG2 中，获得表达载体：pDestTol2CG2;HuC:GABRG2^1027TC–polyA；

（2）显微注射斑马鱼胚胎：将上述 GABRG2 突变体表达载体和 Tol2 转座酶mRNA 显微注射于1-2 细胞期的野生型斑马鱼受精卵中，待胚胎发育至 24 hpf 后，筛选心脏表达绿色荧光的胚胎获得含 GABRG2 突变体序列的阳性斑马鱼。

3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述pDestTol2CG2;HuC:GABRG2^1027TC-polyA 序列如 SEQ ID No：6 所示。

4.如权利要求 1-3任一项所述的构建方法，其特征在于还包括鉴定转基因斑马鱼基因型及获得稳定遗传品系的步骤。

5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于将含 GABRG2 突变体序列的阳性斑马鱼胚胎发育成熟后，通过 PCR 鉴定其基因型，挑选含 GABRG2 突变体序列的阳性斑马鱼与野生型斑马鱼杂交，获得 F1 代斑马鱼，并通过心脏表达的绿色荧光以及基因组 DNA 检测手段，最终筛选获得 GABRG2 突变体斑马鱼系。

6.采用权利要求 1-5任一项所述方法构建的突变型 GABRG2 转基因斑马鱼癫痫模型在癫痫病理研究和抗癫痫药物筛选中的应用。