[发明专利]一种海参花碱性磷酸酶的提取方法

权利要求书

1.一种海参花碱性磷酸酶的提取方法，其特征在于：所述方法具体步骤如下：

步骤一：取新鲜海参花，清洗干净，沥干水分；

步骤二：将步骤一得到的海参花均匀的涂在平皿上进行冻干，厚度为3~5mm，使其水分低于5％，磨粉，放入-80℃冰箱中保存待用；

步骤三：将海参花冻干粉装入超临界CO₂萃取设备的进料釜中，设置萃取压力为20MPa，分离压力为8MPa，萃取分离同时进行，总时间为1.5~2h，保留进料釜中的海参花冻干粉；

步骤四：向步骤三得到的海参花冻干粉中加入Tris-HCl缓冲液，用均质机均质15min，均质后放入超声波设备，超声后用磁力搅拌器搅拌溶解，将溶解好的海参花混合液离心，得到的上清液用饱和度为70％的硫酸铵进行沉淀蛋白，离心后取沉淀用50mM/L Tris-HCl pH8.9缓冲液溶解，经脱盐处理后得到海参花ALP粗酶液；

步骤五：将海参花ALP粗酶液进行阴离子交换层析，填料为DEAE-阴离子层析介质，具体为：

①使用平衡液平衡层析柱，样品上柱，然后用平衡液再平衡；所述的平衡液为50Mm/LTris-HCl pH 8.9；

②进行梯度洗脱，缓冲液A为50 mM/L Tris-HCl pH 8.9，缓冲液B为50mM/L Tris-HClpH 8.9+0.8M/L NaCl，设置洗脱梯度时间为60min，洗脱流速为5ml/min；收集洗脱液，检测酶活，将酶活为50U/mL的洗脱液合并，浓缩至6mL过Chromdex S-200 PG 层析柱，将活力峰收集后浓缩-80℃冷冻保藏。

2.根据权利要求1所述的一种海参花碱性磷酸酶的提取方法，其特征在于：步骤四中，所述的海参花冻干粉与Tris-HCl 缓冲液的质量体积比为2g：200mL，Tris-HCl 缓冲液的浓度为50mM/L，pH为8.9，Tris-HCl 缓冲液中含有0.2%的Triton X-100。

3.根据权利要求1所述的一种海参花碱性磷酸酶的提取方法，其特征在于：步骤四中，所述的超声条件具体为：功率200W，时间15min。

4.根据权利要求1所述的一种海参花碱性磷酸酶的提取方法，其特征在于：步骤四中，所述的离心的具体条件为：10000r/min，20min，4℃。