[发明专利]一种测序文库的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种测序文库的构建方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将M个待测序样本分别转入感受态细菌，划线过夜培养；

(2)从每个待测序样本的感受态细菌中分别挑取N个菌落，进行单独培养；

(3)将包含不同待测序样本的菌液混合，形成N份混合菌液，每份混合菌液中包含M种待测序样本的感受态细菌；

(4)对N份混合菌液分别提取质粒，线性化酶切；

(5)向N份线性化混合质粒添加不同的标签序列，混合后得到测序文库；

其中，M和N为正整数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述待测序样本包括合成的基因片段；

优选地，所述基因片段的长度为500-10000bp，优选为4000-6000bp；

优选地，步骤(2)所述培养在96孔板中进行。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述酶切采用限制性内切酶进行。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于，在步骤(5)之前还包括对线性化酶切质粒进行修复的步骤；

优选地，所述修复包括损伤修复和/或末端修复；

优选地，步骤(5)所述标签序列通过DNA连接酶连接在线性化质粒的两端；

优选地，在步骤(5)之后还包括对文库进行回收纯化的步骤；

优选地，所述回收纯化包括采用磁珠回收后，再用核酸酶消化未连接标签序列的DNA。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)将M个待验证的长度为500-10000bp合成的基因片段分别转入感受态细菌，划线过夜培养；

(2)从每个待测序样本的感受态细菌中分别挑取N个菌落，单独培养在96孔板的同一列中；

(3)将96孔板中同一行的包含不同待测序样本的菌液混合，形成N份混合菌液，每份混合菌液中包含M种待测序样本的感受态细菌；

(4)对N份混合菌液分别提取质粒，采用限制性内切酶进行线性化酶切，修复后得到完整双链的质粒DNA；

(5)采用DNA连接酶向N份线性化混合质粒添加不同的标签序列，混合后用磁珠回收一次，再用核酸酶消化未连接标签序列的DNA，得到测序文库；

其中，M和N为正整数。

6.一种基于三代测序的测序验证方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1’)采用如权利要求1-5任一项所述的方法进行文库构建；

(2’)对构建的文库进行浓度和分布范围的检测；

(3’)三代测序；

(4’)结果分析。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3’)所述三代测序包括Pacbio单分子荧光测序和/或纳米孔测序，优选为Pacbio单分子荧光测序；

优选地，步骤(4’)所述结果分析包括：

根据标签序列和待测序样本的保守序列拆分测序结果；

去除低丰度CCS序列；

将测序结果与参考序列进行比对。

8.一种基因合成方法，其特征在于，所述方法包括将合成的基因片段采用如权利要求6或7所述的方法进行测序验证的步骤。