[发明专利]一种用于菊属植物染色体高分辨率荧光原位杂交的探针及方法

说明书

本发明提供了一种基于菊属植物重复序列设计的寡核苷酸探针套，并公开了一种基于寡核苷酸探针套的菊属植物有丝分裂中期染色体荧光原位杂交方法。具体为：将染色体制片先于‑80℃下保存12h，揭片后放入无水乙醇中脱水30min以上，晾干后制片置于碱变性液中44℃变性5min，室温下置于70.0％、70.0％、100.0％酒精中，依次梯度脱水各5min，气干；配制FISH杂交液并混匀，滴加于染色体制片上，37℃培养箱中进行杂交培养，最后进行信号检测；本发明开发的寡核苷酸探针套和原位杂交方法，可有效的用于菊属植物染色体分析核型图谱的构建(图1)，通过组配好的寡核苷酸探针套通过一次FISH分析进行检测，避免了对一张制片重复多次杂交，大大简化了FISH分析的程序，提高了实验效率。

技术领域

本发明属于分子细胞遗传学研究领域，公开了一种用于菊属植物有丝分裂中期染色体的高分辨率荧光原位杂交的探针及方法。

背景技术

菊花(Chrysanthemum morifolium)起源于我国，品种繁多、色彩丰富、花型多样，是我国十大传统名花和世界四大切花之一，可做观赏、药用、食用等，具有很高的经济价值。菊花隶属于菊科(Asteraceae)春黄菊族菊属，该属以东亚为分布中心，表现出较高的遗传多样性。

荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization，FISH)是分析祖先基因组来源，理清种间进化关系，解析染色体组组成的重要手段之一，也是鉴定异位系、附加系等染色体工程育种的重要手段，其原理是通过将特异的DNA探针进行荧光标记后与DNA靶序列杂交，序列间(探针和靶DNA)的同源性越高，结合的就越充分，直观的反映就是杂交信号的强弱和探针在靶标染色体上的覆盖范围，因而选择合适的探针对获得准确的分子证据至关重要。

常规的荧光原位杂交技术通常以宏基因的全基因组、rRNA或Cot-1DNA作为探针进行原位杂交，然而，由于菊属内不同种间基因组亲缘关系较近，基于菊属全基因组的探针无法用于亲缘关系较近、演化关系复杂的菊属种间比较基因组研究。rRNA基因可在一定程度上用于菊属植物比较基因组研究，但是能提供的信息有限。Cot-1DNA技术灵敏度较低，会导致不同重复间结果存在差异，加之目前基于变性技术的原位杂交探针制备方法和过程繁琐，成本较高，且信号较少，难以从有限的染色体特异位点上区分和鉴定其染色体同源性及结构变异(Qi et al.,2015)。因此，有必要开发更特异的探针、在更精细的灵敏度和更高的基因组覆盖率的基础上来区分菊属不同物种间染色体组成及其结构变异。

发明内容

本发明的目的是针对目前在菊属植物分子细胞遗传学研究中，采用传统荧光原位杂交技术进行分析时，探针制备方法和过程繁琐，成本较高，且信号较少，难以识别的问题，提供基于菊属植物重复序列开发的寡核苷酸探针套和一套简单易行、成本低廉且可靠的荧光原位杂交方法，从而达到获得高分辨率的菊属植物有丝分裂染色体核型，实用性和科学性突出。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

本发明的第一个目的是提供一种寡核苷酸混合探针套，所述寡核苷酸混合探针套序列特征如下：

本发明的第二个目的是提供一种包含前述寡核苷酸混合探针套的寡核苷酸探针套杂交液，所述寡核苷酸探针套杂交液成分包括：dFA 7.5μL，20×SSC 1.5μL，Salmonsperm DNA(鲑鱼精DNA)0.5μL，50.0％Dextran Sulfate(硫酸葡聚糖)2.5μL，寡核苷酸混合探针套4.0μL；将所述成分于1.5mL离心管中混匀，振荡离心后置于105℃的加热块中变性13min，取出后迅速置于-20℃冰酒精中处理10min制备得到。